طريقة تجانس سريعة وبسيطة وموحدة لإعداد مستحلبات المستضد / المستحلبات المساعدة لإحداث التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي أو EAE هو نموذج حيواني يستخدم لتطوير علاجات جديدة ومحسنة لمريض التصلب المتعدد. يتطلب إحداث المرض في EAE مستحلب زيت وماء مثالي لتحقيق نتائج متسقة. طريقة تحضير المستحلب المعروضة هنا خالية من التأثير البشري ، مما يحد من التناقضات من تجربة إلى أخرى.

على الرغم من أن الطريقة قد تم تحسينها ل EAE ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لنموذج أمراض المناعة الذاتية الأخرى وأيضا لاختبار لقاحات السرطان. لتحضير ملاط CFA عند 100 ملليغرام من M tuberculosis H37 RA المجفف بالتجميد وخمسة حبات فولاذية 3.2 ملم إلى أنبوب سعة سبعة ملليلتر. هز الأنبوب في الخالط لمدة 60 ثانية بأعلى إعداد للسرعة.

أضف خمسة ملليلتر من مادة IFA المساعدة إلى الأنبوب ورجها مرة أخرى لمدة 60 ثانية بأعلى سرعة. ثم انقل الملاط إلى أنبوب جديد مع ماصة مع ترك الخرز خلفه وتخزينه عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. لتحضير مستحلب CFA / Peptide ، قم بتنزيل الملف التكميلي الأول لحساب الكمية المطلوبة لكل كاشف.

ثم ضع الأنبوب اللولبي المغطى والكواشف لاستخدامها على الجليد. بعد ذلك ، أضف مكونات المستحلب. أولا PBS ، ثم الببتيد ، ملاط CFA.

وأخيرا ، IFA. أغلق الأنبوب بالغطاء بإحكام عن طريق شده وتخفيفه عدة مرات. هز الأنبوب بقوة لمدة 5 إلى 10 ثوان باليد لخلط الكواشف مسبقا.

ضع الأنبوب في الخالط المهتز وقم بتثبيته بالقضيب. اضبط السرعة على أعلى إعداد والوقت على 60 ثانية. بمجرد الانتهاء من الجري ، ضع الأنبوب على الثلج لمدة ثلاث دقائق وكرر الجري مرة أو مرتين بنفس الإعدادات.

قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 جم من دقيقة واحدة لإزالة الهواء المحبوس وضغط المستحلب. قم بإزالة الغطاء من الأنبوب. أدخل المكبس في الأنبوب ، وادفعه لأسفل ببطء حتى يصل إلى قمة المستحلب.

قم بإزالة العلبة المفاجئة في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق لفها. بعد ذلك ، قم بإزالة المكبس من جميع محاقن الحقن وأضف إبرة إلى محاقن الحقن. ثم قم بتوصيل الجزء الخلفي من حقنة الحقن بالقفل المخصص في الجزء السفلي من الأنبوب وقفله بلف قصير.

انقل المستحلب من الأنبوب إلى حقنة الحقن عن طريق دفع المكبس برفق. توقف عندما يصل المستحلب إلى تخريج 0.15 ملليلتر من حقنة الحقن. افصل حقنة الحقن عن الأنبوب وأدخل المكبس بعناية مع الحرص على عدم دخول الهواء إلى هذه المحقنة.

ادفع المكبس حتى يخرج المستحلب من الإبرة وكرر العملية لبقية المستحلب الموجود في الأنبوب. لتحليل حجم الماء وجزيئات الزيت ، أضف قطرة صغيرة من المستحلب إلى شريحة مجهرية ، وقم بتشويهها بزلة غطاء ، ثم ادفع بقوة بحركة دائرية لتسطيح المستحلب. افحص المستحلب الملطخ تحت مجهر تباين الطور بتكبير 400 مرة وركز على حقل به طبقة أحادية من المستحلب.

تأكد من ظهور جزيئات صغيرة أو موحدة أو رمادية أو بيضاء. عرضت المستحلبات الناتجة عن طريقة التجانس جزيئات رمادية أو بيضاء على شكل حبة تمثل قطرات صغيرة من الماء ومستحلبات الزيت. في المقابل ، كانت قطرات المستحلب الناتجة باستخدام طريقة المحاقن أكبر وأوسع.

في طريقة الدوامة ، لوحظت جزيئات رمادية أو سوداء كبيرة تتوافق مع فقاعات الهواء المحاصرة في المستحلب. لم تظهر التغييرات في توزيع حجم الجسيمات بمرور الوقت المقاسة باستخدام محلل حجم جسيمات الانكسار بالليزر لمستحلبات الماء والزيت أي تغيير في حجم الجسيمات على مدى ستة أسابيع. تسببت المستحلبات الطازجة البالغة من العمر 3 أسابيع و 15 أسبوعا في حدوث أمراض EAE مماثلة في جميع الحيوانات التي تم اختبارها طوال التجربة.

طورت الفئران نمطا مرضيا مشابها في جميع التجارب التي كشفت أن طريقة التجانس المعروضة هنا أنتجت مستحلبات تحفز EAE بطريقة متسقة وقابلة للتكرار. قبل عمل المستحلب للتجربة ، قم بتنزيل الملف التكميلي رقم واحد لحساب كمية كل مكون مطلوب لتقليل النفايات. يمكن استخدام الطريقة المقدمة هنا لتوحيد إعداد المستحلب ليس فقط للبحوث قبل السريرية ، ولكن أيضا في المستقبل لإعداد لقاحات السرطان في العيادة.