القياس الكمي لمعقدات الميلوبيروكسيديز - الحمض النووي و Neutrophil Elastase-DNA من مصائد العدلات خارج الخلية باستخدام شطيرة ELISA المعدلة

وقد اجتذبت الشبكات اهتماما مؤخرا، ولكن ثبت أن تحديد كمية الشبكات في الجسم الحي يمثل تحديا. يوفر هذا البروتوكول طريقة مرغوبة وحساسة للغاية وقيمة للتحقيق في خصائص الشبكات في البيئات السريرية. يجب أن تمتد هذه التقنية لتقييم شدة الإنتان أو متلازمة الضائقة التنفسية الحادة ، متلازمة الضائقة التنفسية الحادة.

من المقبول على نطاق واسع أن تنظيم المقالب أو الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر هو مفتاح لتحسين الحالة السريرية للإنتان. تتضمن أكبر ميزة لهذه الطريقة القياس الكمي الدقيق للبقايا الصافية المتداولة مثل myeloperoxidase-DNA و edastrovail elastase-DNA في وقت قصير. ينصح بتدوير العينات قبل الفحص وتجنب الذوبان المتكرر.

من المهم اتباع أوقات الحضانة كما هو موضح في البروتوكول. ابدأ بتخفيف العدلات متعددة الأشكال النووية المعزولة حديثا إلى 10،000 خلية لكل مليلتر في RPMI 1640 الخالي من الفينول الأحمر. غربالهم في أطباق ثقافة 35 ملم.

للحث على مصائد العدلات خارج الخلية أو NETs ، قم أولا بتحفيز العدلات متعددة الأشكال النووية باستخدام 25 نانومولار PMA. ثم هضم جزئيا الفخاخ خارج الخلية عن طريق إضافة 0.6 ميكروغرام لكل ملليلتر من DNase I ، واحتضان الخليط لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن ، أضف خمسة ملليمولار EDTA لإيقاف نشاط DNase ، واجمع الوسط الذي يحتوي على الشبكات المركبة.

أجهزة طرد مركزي لإزالة حطام الخلية. جمع المواد الطافية من أربعة ضوابط صحية. اخلطها وقم بتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها مرة أخرى.

ماصة 100 ميكرولتر من مضاد الميلوبيروكسيديز المخفف الذي يحتوي على 0.05 ميكروغرام من الجسم المضاد في لوحة ELISA. الآن ، قم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي لاصق لمنع تبخر العينة ، واحتضان العينة طوال الليل عند أربع درجات مئوية للسماح بربط الأجسام المضادة الملتقطة . في اليوم التالي ، تخلص من محلول الأجسام المضادة المخفف من الآبار ، وماصة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل في كل بئر.

اضغط على الطبق الجاف على منشفة ورقية لإزالة PBS الزائد. سد كل بئر من اللوحة مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. قم بتغطيته بغطاء بلاستيكي لاصق ، وقم بإعاقة الآبار عن طريق احتضانه.

بعد التخلص من محلول الحجب من الآبار وغسل اللوحة ثلاث إلى أربع مرات ، اضغط عليها جافة على منشفة ورقية. بعد ذلك ، ماصة 25 ميكرولتر من البلازما في جميع الآبار باستثناء الفراغ. وتخفيفه ب 75 ميكرولتر من PBS ، مما يجعل حجم البئر النهائي 100 ميكرولتر.

ثم أضف 100 ميكرولتر من PBS إلى البئر الفارغة. امزج العينات عن طريق وضع اللوحة على شاكر لمدة 10 ثوان عند 250 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف ميكرولتر من 100 DNase I المخفف بالكامل إلى جميع الآبار ، وضع اللوحة المختومة على الخلاط لمدة 10 ثوان لخلط العينات جيدا.

احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف ميكرولترا واحدا من 0.5 مولار EDTA إلى كل بئر لإيقاف تفاعل DNase. ثم ضع اللوحة المختومة على شاكر لمدة 15 ثانية لخلط العينات جيدا.

أخيرا ، احتضان اللوحة طوال الليل عند أربع درجات مئوية للسماح لمكونات البروتين في الشبكات بالالتصاق بالأجسام المضادة الملتقطة . في اليوم التالي ، تخلص من المحلول من الآبار. بعد غسل الآبار عدة مرات ، ماصة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف عن الحمض النووي المخفف المترافق بالبيروكسيديز في كل بئر.

احتضان اللوحة لمدة 1 1/2 ساعة ، ثم تخلص من المحلول في الآبار. بعد غسل الآبار ثلاث مرات ، ماصة 100 ميكرولتر من محلول الركيزة ABTS في كل بئر ، واحتضان لوحة مختومة على شاكر في الظلام. أوقف التفاعل بإضافة 50 ميكرولترا من حمض الكبريتيك ثنائي الضرس.

امزج محتويات البئر عن طريق النقر بعناية على جوانب اللوحة. بعد ذلك ، قم بتوصيل قارئ microplate بالكمبيوتر وابدأ تشغيل تطبيق البرنامج. من شريط الحالة، أنشئ تجربة جديدة وقم بتسميتها.

ثم قم بتعيين معلمات قراءة اللوحة عن طريق تحديد Absorbance كنوع القراءة ، ونقطة النهاية كوضع القراءة ، واثنين كأطوال موجية. بعد ذلك ، اضبط لامدا واحد على أنه 405 نانومتر ، لامدا اثنان على أنه 490 نانومتر. الآن ، حدد حالة إيقاف التشغيل لكل من Automix و Blanking مع الاحتفاظ بالمعايرة التلقائية على أنها قيد التشغيل ، ثم حدد قراءة اللوحة بأكملها ضمن الشرائط.

أخيرا ، قم بتعيين أولوية الطول الموجي للعمود مع عادي كسرعة النقل ، ثم حدد إيقاف ضمن القراءة التلقائية. ضع اللوحة جيدا في درج الأدوات وأغلقها. انقر فوق قراءة حتى تتم قراءة اللوحة على الفور.

اقرأ امتصاص كل بئر عند 405 نانومتر ، وقم بإجراء الطرح التلقائي لامتصاص وسط الفحص من جميع العينات غير المعروفة. تم الحصول على منحنيات معايرة قياسية موثوقة لكل من MPO-DNA و NE-DNA عندما لم تتجاوز قيم الامتصاص 0.93 و 0.9 على التوالي. تم الحصول على أعلى OD عندما تم تطبيق 0.6 ميكروغرام لكل ملليلتر من DNase I.

كانت معاملات التباين بين المقايسة للمجمعات في الضوابط الصحية 1.871 و 0.987 على التوالي ، بينما أظهر مرضى COVID-19 معاملات تقلب تبلغ 2.532 و 2.010 على التوالي. كان متوسط معاملات التباين بين المقايسة ل MPO-DNA و NE-DNA 6.524 و 4.389 على التوالي. أظهرت خصوصية الأجسام المضادة الملتقطة لمجمعات MPO-DNA و NE-DNA أن الأجسام المضادة للتحكم من نوع iso تفاعلت قليلا مع المجمعات.

كانت النسبة المئوية لكلا المعقدين أعلى في البلازما من مرضى COVID-19 مقارنة بالضوابط الصحية. يجب تحسين وقت هضم إناز ، وإلا فإن الهضم المفرط سيقلل من الامتصاص.