دراسة التفاعلات بين إنزيمات هيستون المعدلة وعوامل النسخ في الجسم الحي عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري
October 14th, 2022
نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) هو تقنية تصوير للكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول FRET لدراسة ارتباط الإنزيمات المعدلة للهيستون بعوامل النسخ التي تجندها إلى المروجين المستهدفين للتنظيم اللاجيني للتعبير الجيني في الأنسجة النباتية.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في تفاعل البروتين والبروتين ، وستسمح لنا بالكشف مباشرة عن بروتينين يقعان على بعد 10 نانومتر من بعضهما البعض داخل الخلية الحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وسهلة التكاثر. كما يتطلب مواد بسيطة متوفرة في العديد من المختبرات الحديثة.
يمكن استخدام هذا المقياس مع أي نسيج حي أو خلية ثقافة تنتشر بشكل انتقالي عند البروتين محل الاهتمام. إذا كنت تستخدم هذه التقنية لأول مرة ، فمن المستحسن أن تستخدم التحكم الإيجابي والتحكم السلبي لاختبار النظام أولا. للبدء ، زرع بذور Nicotiana benthamiana في وعاء يحتوي على تربة رطبة بكثافة عالية.
احتفظ بالبذور المزروعة في غرفة نمو عند 23 درجة مئوية. عندما يصل قطر euphyll إلى 0.3 إلى 0.5 سم ، انقل الشتلات إلى أواني أكبر واتركها تنمو في نفس الغرفة بنفس المعلمات. بعد ذلك ، قم بإعداد الخلايا البكتيرية للتسلل الزراعي عن طريق تلقيح كل مستعمرة من البكتيريا الزراعية التي تحتوي على تركيبات FRET في خمسة ملليلتر من وسط LB المكمل بالمضادات الحيوية و 150 ميكرومولار أسيتوسيرينجون.
احتضان الثقافة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 3،000 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للتسلل الزراعي إلى OD 600 من 0.5.
بالنسبة للتسلل الزراعي المزدوج البناء ، ادمج الخلايا المعاد تعليقها بنسبة حجم واحد إلى واحد مع الخلايا التي تحتوي على التركيبات المناسبة. احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. لأداء التسلل الزراعي ، قم بتحميل الثقافة البكتيرية في حقنة عديمة الإبر ملليلتر.
برفق ولكن بحزم ، اضغط على فوهة المحقنة على الجانب المحوري من أوراق نيكوتيانا بينثاميانا الموسعة بالكامل أثناء إمساك الورقة بإصبع قفاز على الجانب المحوري. تسلل ما يصل إلى أربع بقع على ورقة ، وثلاث أوراق لكل نبات ، واثنين أو ثلاثة نباتات لكل مزرعة بكتيرية. الحفاظ على النباتات الزراعية المتسللة في نفس غرفة النمو في ظل نفس الظروف كما هو موضح سابقا لمدة 24 إلى 36 ساعة.
بعد 24 إلى 36 ساعة من التسلل ، استخدم شفرة حلاقة لقطع كل ورقة زراعية إلى قطع صغيرة من اثنين في أربعة ملليمترات بين الأوردة. ضع قطع الأوراق على شريحة زجاجية بحيث يكون سطح الورقة المحوري متجها لأعلى. ضع قطرة ماء على قطع الأوراق وقم بتغطيتها بزجاج الغطاء.
اضغط قليلا على زجاج الغطاء لإزالة فقاعات الهواء. ثم قم بتشغيل المجهر والليزر. ضع الشريحة في حامل مرحلة المجهر.
لإعداد معلمات SE-FRET ، افتح أداة الاستحواذ متعددة الأبعاد. ثم اضبط قناة المتبرع لإثارة وانبعاث الفلوروكروم GFP المانح بليزر إثارة يبلغ 405 نانومتر ، ومرشح انبعاث عند 400 إلى 597 نانومتر. اضبط قناة المستقبل لإثارة وانبعاث متقبل الفلوروكروم mRFP وليزر إثارة يبلغ 561 نانومتر ومرشح انبعاث من 400 إلى 597 نانومتر.
اضبط قناة FRET لإثارة المتبرع وانبعاث الفلوروكرومات المتقبلة باستخدام ليزر إثارة 405 نانومتر ومرشح انبعاث 597 إلى 617 نانومتر. اضبط شدة إثارة المتبرع عند الحد الأدنى لمراقبة FRET مع تجنب التبييض الضوئي. إثارة المتبرع والمسح بحثا عن الخلايا التي تحتوي على إشارة التألق المتوقعة من المتقبل.
حدد المنطقة التي تحتوي على إشارة التألق محل الاهتمام. احصل على تسلسل صور SE-FRET بالضغط على زر المفاجئة. لإعداد معلمات AB-FRET ، استخدم معلمات قناة المتبرع والمتقبل المحددة ل SE-FRET ، ولكن قم بإيقاف تشغيل قناة FRET.
ثم استعد لتعيين معلمات التبييض الضوئي ل mRFP المتقبل. تأكد من أن التبييض يبدأ بعد خمس صور. السماح ب 200 تكرار لكل منطقة مبيض.
حافظ على كثافة الليزر بنسبة 100٪ عند 561 نانومتر. حافظ على مدة التبييض 45 ثانية. تأكد من سرعة مسح ضوئي تبلغ 512 × 512 بكسل عند 400 هرتز.
ابحث وارسم منطقة الخلية المراد تبييضها ، وقم بتنشيط التبييض بالضغط على زر بدء التجربة. في حالة التحكم الإيجابي ، بعد خمس صور ، يبدأ التبييض ، وتتحول منطقة الاهتمام إلى اللون الأخضر. تحقق من متوسط عائد الاستثمار للتأكد من أن كثافة mRFP تتناقص بينما تزداد كثافة GFP.
بدلا من ذلك ، تحقق من التخطيط ، مما يدل على أن mRFP كان يبيض وأن GFP كان يتزايد. لتحليل بيانات SE-FRET ، استخدم برنامج ImageJ. افتح الصور وأنشئ كومة من المتبرعين فقط.
احفظ الصور في ثمانية بت كملف TIF. وبالمثل ، قم بإنشاء المكدس للمتقبل فقط ، ثم قم بإنشاء مكدس مدمج من المتبرع والمتقبل. بعد ذلك ، استخدم المكون الإضافي PixFRET لإنشاء صور لكفاءة SE-FRET.
افتح الحزم التي تم إنشاؤها ، وقم بإنشاء صور FRET المصححة بعد طرح النزيف الطيفي. قدم الصورة كصورة زائفة. لتحليل بيانات AB-FRET ، احسب النسبة المئوية AB-FRET كنسبة مئوية للزيادة في انبعاثات GFP بعد التبييض الضوئي mRFP باستخدام هذه الصيغة.
تمت دراسة تفاعل البروتين والبروتين المحدد لهيستون deubiquitinase OTLD1 مع عامل النسخ LSH10 بواسطة SE-FRET. تم تسجيل نوى الخلية في وقت واحد في ثلاث قنوات ، وتم إنشاء مقياس لون زائف لتصوير كفاءة SE-FRET. يتوافق الانتقال من الأزرق إلى الأحمر مع زيادة في كفاءة FRET وقرب البروتين والبروتين.
كانت كثافة SE-FRET بعد التعبير المشترك ل LSH10 و OTLD1 مماثلة لتلك التي لوحظت للتحكم الإيجابي mRFP-GFP. لم يلاحظ أي SE-FRET في الضوابط السلبية مثل التعبير المشترك عن OTLD1 و mRFP و LSH4-GFP أو mRFP الحر و LSH10-GFP. أظهرت صور AB-FRET أن التعبير المشترك ل LSH10-GFP و OTLD1-mRFP أدى إلى زيادة مضان مانحي GFP بعد أن تم تبييض متقبل طلب تقديم العروض ضوئيا.
لوحظت زيادة مماثلة في مضان المانحين في السيطرة الإيجابية ، ولكن ليس في الضوابط السلبية عندما تم تعطيل مضان المستقبل. أظهر التحليل الكمي لبيانات AB-FRET زيادة ذات دلالة إحصائية في مضان المانحين بعد التعبير المشترك LSH10 و OTLD1. أنتجت السيطرة الإيجابية نسبة AB-FRET بنسبة 30٪ تقريبا بينما لم تنتج الضوابط السلبية أي شيء.
أظهر SE-FRET و AB-FRET إشارة في نواة الخلية تتفق مع التوطين تحت الخلوي لمركب الإنزيم المعدل لعامل النسخ بالإضافة إلى الطبيعة النووية لبروتينات GFP-MRFP. أهم شيء يجب تذكره قبل اتباع البروتوكول هو الاختبار في الزوج السريع لمستقبل المتبرع الصحيح اعتمادا على نموذج الفحص النانوي متحد البؤر. بعد التشغيل والقيام بالتكرار ، يستغرق الأمر من 24 إلى 36 ساعة فقط لتلقي النتائج.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدى المرء فهم جيد لكيفية استخدام تقنية FRET لدراسة تفاعل البروتين والبروتين.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكول FRET للتحقيق في تفاعلات البروتين داخل الخلايا النباتية الحية، مع التركيز بشكل خاص على الارتباط بين الإنزيمات المعدلة للهيستون وعوامل النسخ المتورطة في تنظيم الجينات. باستخدام نبات نيكوتيا بنثاميا كنظام نموذجي، تسلط النتائج الضوء على إمكانات هذه التقنية في تحليل تفاعلات البروتين-البروتين وديناميكياتها.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- تفاعلات البروتين-البروتين
- تنظيم التعبير الجيني
- التعديلات اللاجينية في النباتات
الخلفية
- فهم الارتباط بين الإنزيمات المعدلة للهيستون وعوامل النسخ أمر حاسم لتوضيح تنظيم الجينات.
- تتيح تقنية FRET الكشف عن التفاعلات ضمن نطاق النانومتر في الخلايا الحية.
- يمكن توحيد هذه الطريقة لمختلف التطبيقات البيولوجية في أبحاث النباتات.
الطرق المستخدمة
- تصوير نقل الطاقة بالرنين الفلوري (FRET)
- نيكوتيا بنثاميا كنظام بيولوجي
- استخدام الزراعة المائية لتعبير البروتين وتحليله
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح للتفاعل بين OTLD1 وLSH10 باستخدام SE-FRET.
- أكدت التجارب الضابطة على خصوصية التفاعلات التي لوحظت.
- دعم التحليل الكمي الاستنتاجات التي تم التوصل إليها فيما يتعلق بقرب البروتين ودينامياته في التفاعل.
الاستنتاجات
- تظهر الدراسة فائدة FRET في تحليل تفاعلات البروتين في النظم النباتية.
- تسهم هذه الدراسة في فهم آليات التنظيم اللاجيني في التعبير الجيني.
الأسئلة المتكررة
Executive Industry Relevance
Directly quantifying interactions between histone modifying enzymes and transcription factors in living cells addresses a critical challenge in target validation for epigenetic drug discovery. FRET-based detection of protein proximity within 10 nm enables mechanistic de-risking and increases predictive confidence in early discovery. This capability supports portfolio decisions by clarifying functional protein complexes relevant to gene regulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein-protein interactions in native cellular environments.
- Supports functional validation of epigenetic targets by confirming complex formation in vivo.
- Reduces mechanistic ambiguity in pathway analysis for gene regulation.
- Improves predictive confidence for advancing targets into screening pipelines.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening.
- Provides quantitative, reproducible readouts of protein interaction efficiency.
- Enables assay standardization using positive and negative controls for robust data.
- Supports scalability and platform reuse across diverse protein pairs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic findings with disease-relevant chromatin regulation pathways.
- Ensures continuity from discovery-stage interaction mapping to preclinical model validation.
- De-risks translational advancement by confirming in vivo relevance of protein complexes.
Pipeline & Workflow Integration
This FRET-based method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a bridge from hypothesis-driven target validation to quantitative screening workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing direct protein interactions in living tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative FRET efficiency measurements for assay readiness.
- Analytics: Enables statistical comparison of interaction strength across experimental conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease-relevant chromatin regulation when supported by biological context.
- Enterprise Reuse: Adaptable to diverse protein pairs and model systems for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Offers standardized, reproducible protocols compatible with common laboratory infrastructure.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through early mechanistic clarity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets and complexes for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and protein labeling strategies.
- Needs access to confocal nanoscopy and compatible FRET imaging platforms.
- Demands rigorous use of positive and negative controls for assay standardization.
- Adaptable across plant and potentially mammalian systems with appropriate construct design.
- Dependent on spectral compatibility of donor-acceptor fluorophore pairs and imaging system.
