الثقافة طويلة الأجل لالتهاب Caenorhabditis elegans الفردي على الوسائط الصلبة لمراقبة التألق الطولي والتدخلات البعيدة

هنا ، نقدم بروتوكولا لزرع الديدان الخيطية الفردية المعزولة على وسائط صلبة لتتبع المعلمات الفسيولوجية مدى الحياة والقياس الكمي الفلوري. يتضمن نظام الاستزراع هذا حاجزا من حمض النخيل حول آبار دودة واحدة لمنع الحيوانات من الفرار ، مما يسمح باستخدام التدخلات المكروهة ، بما في ذلك البكتيريا المسببة للأمراض والضغوطات الكيميائية.

في حين توجد طرق أخرى للاستزراع الصلب، فإن هذا هو أول نظام استزراع صلب يسمح بالتتبع الطولي الآلي لحياة الحيوان الفردية ومدى صحته والتصوير الطولي للمؤشرات الحيوية الفلورية في نظام واحد. يوفر هذا البروتوكول نتائج قابلة للمقارنة مع تجارب C.elegans القياسية على NGM الصلب متوافق مع كل من التدخلات المكروهة والتصوير المباشر الفلوري. سيكون هذا النظام لا يقدر بثمن لأبحاث الشيخوخة ، خاصة فيما يتعلق بالتعرض طويل الأمد للضغوط البيئية ومراقبة ديناميكيات الجينات والبروتين على مدى فترات طويلة.

يعد تجنب التلوث والحصول على تجفيف ثابت عبر الآبار أمرا صعبا. لقد سلطنا الضوء على النقاط الرئيسية في البروتوكول المكتوب لتقليل هذه المشكلات. للبدء ، قم بطحن 500 ملليغرام من حمض البالمتيك الصلب في الهاون والمدقة.

امزجه مع 15 ملليلتر من TWEEN 20 في قارورة مخروطية سعة 50 ملليلتر ، واخلطها عن طريق الدوامة لإذابة البلورات. أضف 17.5 ملليلتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ، ودوامة المحلول لإذابة أكبر قدر ممكن من حمض البالمتيك. ثم أضف 17.5 ملليلتر من الماء عالي النقاء ، والدوامة بقوة.

سخني المحلول برفق في حمام حبة عند 80 درجة مئوية حتى يذوب حمض البالمتيك تماما. أعد تسخين حمام الخرزة إلى 80 درجة مئوية. مباشرة قبل الاستخدام ، قم بقسمة ملليلتر واحد من محلول عمل حمض النخيل لكل Microtray في حاوية معقمة منفصلة ، وأضف أربعة ميكرولتر من النيستاتين لكل ملليلتر واحد من محلول حمض النخيل قبل التسخين.

الآن رش داخل وخارج Microtray مع الإيثانول للتشبع ، والتخلص من الإيثانول الزائد. لتعقيم Microtray ، ضع اللوحة والغطاء بشكل منفصل في رابط متقاطع للأشعة فوق البنفسجية. بعد 20 دقيقة ، اقلب اللوحة والغطاء.

بعد ذلك ، ضع القارورة المخروطية سعة 15 ملليلتر مع محلول عمل حمض النخيل في حمام الخرزة ، واترك أي بلورات مرئية تذوب تماما قبل الاستخدام. قم بتسخين Microtray عن طريق وضعه على الحافة المحيطة بحمام الخرزة مع وضع الأغطية لمدة دقيقتين. قم بإزالة غطاء Microtray ، وأضف ببطء 200 ميكرولتر من محلول عمل حمض النخيل عبر الجدار الخلفي لل Microtray.

استبدل الأغطية ، واترك Microtray يجلس على حمام الخرزة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق للسماح لمحلول حمض البالمتيك بالاستقرار عبر الجزء السفلي من Microtray. قم بتدوير Microtray 180 درجة ، وأضف محلول عمل حمض البالمتيك كما هو موضح سابقا. قم بإعداد lmNGM بإضافة المكونات الموضحة في المخطوطة.

ثم ماصة 20 ميكرولتر من lmNGM في كل Microtray وضعت على مقاعد البدلاء. تأكد من تغطية Microtray عند إعادة ملء الماصة لتقليل التلوث. لزرع آبار Microtray بالطعام البكتيري ، قم بطرد مركزي ثقافة نمت بين عشية وضحاها عند 3،500 جم لمدة 20 دقيقة.

قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق مزرعة البكتيريا بتركيز عشرة أضعاف بمحلول كلوريد الصوديوم 85 مللي مولار. ثم قم بسحب خمسة ميكرولترات من الثقافة البكتيرية المركزة بعشرة أضعاف بعناية على سطح lmNGM في كل بئر. تجنب السماح لثقافة البكتيريا بالمرور على جانب البئر وفي حمض النخيل ، لأن هذا سيجذب الديدان لمغادرة البئر.

ضع الملحق المطبوع 3D المعقم في لوحة بئر واحدة معقمة. ضع Microtray في المحول المطبوع 3D في لوحة البئر الواحدة. قم بتوزيع بلورات الماء بحرية أعلى الملحق المطبوع 3D بين البئر الخارجي للدرج الدقيق والجدار الداخلي للوحة البئر الواحدة.

إذا لم تتم إضافة الديدان على الفور ، فقم بإغلاق Microtray لاستخدامها في اليوم التالي. أغلق غطاء الدرج ، واستخدم قطعة واحدة من Parafilm للف الجوانب الأربعة لإغلاق Microtray. كرر خطوة الختم مع Parafilm مرتين أخريين لثلاث طبقات.

أضف دودة واحدة لكل بئر بمجرد وصولها إلى مرحلة الحياة المطلوبة. أضف 40 ميكرولترا من محلول المنظف إلى غطاء لوحة بئر واحدة ، واستخدم مسح المهام لتغطية الغطاء بالتساوي. استخدم مناديل مهام إضافية لنشر محلول المنظف حتى لا يتم تشويه الرؤية من خلال الغطاء.

قم بتمديد القطعة الأولى من Parafilm قليلا لتغطية جانبي الدرج. امسح الجزء العلوي من الدرج بمسح المهام ، وقم بترطيبه باستخدام 70٪ من الإيثانول لإزالة أي بصمات أصابع. قم بقياس العمر الافتراضي عن طريق النقر برفق على جانب اللوحة أو أعلى اللوحة ، أو تسليط ضوء أزرق ساطع على اللوحة ، ومراقبة كل.

سجل حيوانا ميتا إذا لم يتحرك في غضون ثوان قليلة. كرر هذه المهمة كل يوم إلى ثلاثة أيام حتى تموت جميع الديدان. إجراء التصوير الفلوري على الآبار الفردية.

التعرض لكبريتات النحاس وديثيوثريتول قلل بشكل كبير من عمر الدودة ومدى الصحة. في المقابل ، قللت كبريتات النحاس من نسبة الحياة التي تقضيها بصحة جيدة ، في حين أن ديثيوثريتول لم يفعل ذلك. خفضت كبريتات النحاس متوسط النشاط بين الأفراد داخل السكان إلى حد أكبر من ديثيوثريتول في جميع الأعمار.

متوسط السكان في المنطقة الحيوانية الفردية تحت منحنى النشاط مدى الحياة ضعيف بشكل كبير بواسطة كبريتات النحاس أو ديثيوثريتول. يرتبط النشاط التراكمي للحيوانات الفردية حتى اليوم 10 بعمرها الافتراضي للحيوانات التي تواجه تحدي الديثيوثريتول ، ولكن ليس للضوابط غير المعالجة أو الحيوانات التي تواجه كبريتات النحاس. لوحظت زيادة كبيرة في تعبير KYNU-1 بين اليومين الثالث والثامن من مرحلة البلوغ ، وهناك انخفاض تدريجي مع تقدم العمر بعد ذلك.

يرتبط التعبير القرمزي التراكمي KYNU-1 mScarlet خلال اليوم 14 من مرحلة البلوغ بعمر الحيوان. نظرا لأن تعبير KYNU-1 ديناميكي طوال العمر ، فقد قارنا تعبير KYNU-1 في أعمار مختلفة بالبقاء على قيد الحياة بشكل عام عبر الحيوانات الفردية. في أي وقت من الأوقات كان تعبير KYNU-1 مرتبطا بشكل كبير بالبقاء على قيد الحياة.

عند محاولة هذا الإجراء ، فإن أهم الخطوات هي إضافة حمض البالمتيك ، وسحب الأجار ، وإدخال الديدان. تسمح هذه التقنية بالتتبع الطولي للعمر والعمر الصحي ، بالإضافة إلى المؤشرات الحيوية الفلورية في الديدان الفردية بطريقة يمكن مقارنتها مباشرة بمقايسات NGM.