تحليل وتصوير الخلايا العظمية

يفترض أن إجهاد قص تدفق السوائل هو محفز ميكانيكي للخلايا العظمية. نظرا لأن القياس المباشر ليس خيارا ، فإن النماذج المشتقة من الصور متحدة البؤر للخلايا العظمية هي أداة قيمة لإجراء تحليل ديناميكيات السوائل الحسابية لتقييم الضغوط المطلقة لتدفق السوائل على الأغشية المتغصنة للخلايا العظمية. تتوافق بعض الأعمال المنجزة في مختبرنا مع التطورات الحديثة في هذا المجال حيث يتم استخدام مورفولوجيا ثغرات الخلايا العظمية الفعلية ، بما في ذلك التواء وكثافة التشعبات ، جنبا إلى جنب مع شبكة العظام والقناة الجوقة من أجل تحديد إجهاد قص تدفق السوائل عدديا والمواقع في الهيكل المتغصني للخلايا العظمية حيث يكون الضغط مرتفعا.

تشمل التقنيات الحالية العديد من النمذجة الحسابية ، مثل تحليل العناصر النهائية ، وديناميكيات السوائل الحسابية ، وتفاعل بنية السوائل ، والنمذجة القائمة على الصور ، بما في ذلك الأشعة السينية أو المجهر متحد البؤر لنماذج ثلاثية الأبعاد دقيقة وأنظمة الاختبار الميكانيكية للتحقق من صحة النماذج عن طريق قياس استجابات العظام مثل السلالات في ظل ظروف تحميل التحكم. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن فقدان التشعبات بسبب الشيخوخة أو أمراض العظام هو عامل يجعل العظام أقل استجابة للنشاط البدني. توقعنا أن تكتشف الخلايا العظمية الأحمال الميكانيكية من خلال مناطق إجهاد القص عالية التدفق السائل وهي التشعبات.

ويرتبط إجهاد قص تدفق السوائل بمورفولوجيا الفراغ ، وخاصة مساحة السطح. مع إنشاء هذا البروتوكول ، نعمل الآن على مشروع المعاهد الوطنية للصحة لدراسة إجهاد قص تدفق السوائل في تشعبات الخلايا العظمية لعظام الفئران من عمرين وجنسين مختلفين. ستساعد هذه الدراسة في تحديد كيفية تأثير الشيخوخة والاختلافات بين الجنسين على نقل التنبيغ الميكانيكي في العظام بسبب التحميل.

للبدء ، قم بإصلاح عظم الفخذ الذي تم جمعه من الفأر في بارد 4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف. في اليوم التالي ، اشطف العظم والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات وقم بتضمينه بسرعة في أكريليك سريع البلمرة. قطع شرائح عرضية سميكة 300 ميكرومتر فوق المدور الثالث.

باستخدام ورق الصنفرة ، قم بتلميع أقسام العظام إلى سمك نهائي من 90 إلى 100 ميكرومتر. ثم اشطف الأقسام المصقولة بنسبة 70٪ 95٪ و 100٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق لكل منهما. تلطخ الأقسام في 1٪ مناسب C في 100٪ إيثانول لمدة أربع ساعات في الظلام مع اهتزاز معتدل.

بعد ذلك ، اغسل الأقسام جيدا في 100٪ من الإيثانول. وجففها بالهواء طوال الليل قبل وضعها في قطرة من وسائط التثبيت على شريحة زجاجية. قم بتركيب زلة غطاء على العينة.

على المجهر متحد البؤر ، قم بتعيين ليزر 488 نانومتر للإثارة ونافذة تجميع الانبعاثات من 496 إلى 596 نانومتر. أولا ، التقط صورة منخفضة الطاقة لقسم العظام بأكمله باستخدام هدف 5x. ثم التقط صورا للمناطق الثلاث ذات الاهتمام باستخدام هدف 20x.

استخدم هدف زيت فتحة رقمية 100 × 1.44 مع تكبير/تصغير رقمي يبلغ 1.7 وحجم خطوة يبلغ 0.126 ميكرومتر لتجميع مجموعات Z مفصلة من طائرات 400 Z بدقة 1024 × 1024 بكسل ودقة 0.089 ميكرومتر بكسل. لنمذجة الكمبيوتر لخلايا عظم الفأر ، افتح برنامج ImageJ بعد استيراد صور مكدس Z المجمعة لعظم الفخذ بتنسيق TIFF ، واضبط العتبة في قائمة القسم لتغيير حدود شدة البكسل لتضمينها في قناع. باستخدام عملية قناع المحاصيل ، قم بقص ثغرة واحدة مع قنواتها كمنطقة أهمية.

قم بتغليف الثغرة في مكعب وهمي أكبر بأطوال أضلابية تبلغ 21 و 14 و 19 ميكرومتر. قم بإجراء عملية تنمية منطقة لتحديد مناطق البكسل المتصلة لإنشاء شبكة قناة جوقة موحدة أو LCN. بعد ذلك ، باستخدام عملية الجزء المحسوب ، قم بتحويل القناع القناة الجوائية إلى كائن.

تقليل حجم LCN باستخدام عملية التنعيم لبناء الخلايا العظمية والأغشية المتغصنة. ثم قم بتصدير الكائنات. اجمع بين سطحين من LCN والأغشية المتغصنة للخلايا العظمية في سطح واحد.

الآن ، استخدم عملية remesh لإنشاء نموذج حجمي لمساحة القناة الجوذية. قم بتصدير النموذج كملف STL واضبط مقياس الكائن على ميكرومتر. في برنامج معالجة ثلاثي الأبعاد قائم على الصور ، اختر النموذج الحجمي لمساحة الفأر القناة الفراغية كنموذج أساسي لبناء نماذج خلايا العظام المتميزة.

حدد عتبة أقل لتقليل شدة الضوء للصورة والحصول على ثغرة بها عدد أقل من القنوات. بعد ذلك ، قم بتطوير نماذج الخلايا العظمية بسماكات مختلفة من مساحة القناة الجوائية أو أقطار القناة المتغصنة. قم ببناء نماذج أكبر أو أصغر لخلايا العظام باستخدام عمليات التغليف أو التنعيم على التوالي.

لإنشاء تدفق سائل في برنامج المحاكاة ، قم باستيراد الأشكال الهندسية المطورة المستندة إلى الصور متحدة البؤر إلى برنامج CFX. اضبط أبعاد الوحدة على نانومتر. بعد ذلك ، انقر فوق الطرح لتحقيق جسم واحد من مساحة الكانيروس الجوذية.

انقر بزر الماوس الأيمن على الوجه الذي تم إنشاؤه وقم بتحويله من الواجهات إلى مجال صلب دون دمج الوجوه. انقر فوق الشبكة وحدد عناصر خطية رباعية السطوح بحجم عنصر 0.06 ميكرومتر. صقل الشبكة بدراسة تقارب شبكية.

الآن ، حدد السطح واختر القنوات الموجودة على الجانب العلوي من المكعب الوهمي كمداخل سائلة. باستخدام الصندوق ، اختر القنوات على الوجوه الخمسة الأخرى كمنافذ للسوائل. ثم تصدير الشبكة.

بعد إنشاء تدفق سائل آخر ، قم باستيراد الشبكة بطلاقة إلى قسم الإعداد في CFX. باستخدام خيار إدراج الحدود ، حدد شرطين حدوديين للمداخل والمخارج للوجوه. مارس ضغط مدخل سائل يبلغ 300 وصفر باسكال على المداخل والمخارج على التوالي.

تعامل مع الأسطح المتبقية كجدران بحالة عدم الانزلاق. من مكتبة المواد ، تعامل مع السائل الصفحي الخلالي كماء. اضبط أقسام نقل الحرارة والاحتراق والإشعاع الحراري على لا شيء.

حدد الاضطراب كخاصية السائل في LCN. بعد ذلك ، قم بتشغيل البرنامج باستخدام الدقة المزدوجة والبدء المباشر كنوع الإرسال. أدخل محيطا جديدا في قسم النتائج في برنامج CFD.

قم بإنشاء إجهاد قص تدفق السوائل أو محيط FFSS عن طريق اختيار قص الجدار على الأغشية المتغصنة للخلايا العظمية كمتغير في المجال. بعد ذلك ، أدخل سرعة تبسيط محيط داخل المجال الجوبي القناة بدءا من المداخل. كان متوسط FFSS على الخلايا العظمية والأغشية المتغصنة في نموذج الخلايا العظمية الشابة 0.42 باسكال ، وهو أعلى بكثير من 0.13 باسكال في نموذج الخلايا العظمية القديمة.

زادت FFSS في الخلايا العظمية ذات المساحة القناية الأكبر كما هو موضح في النموذج السابع والنموذج الثامن حيث أظهر النموذج الثامن أعلى FFSS. لوحظت أدنى قيم FFSS البالغة 0.19 باسكال و 0.13 باسكال في النموذج الثاني والنموذج الرابع على التوالي بأقل كثافة قناة. لم يلاحظ أي تغيير كبير في FFSS مع زيادة قطر التغصنات كما هو موضح في النموذجين الخامس والسادس.