مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

تم تصميم مقايسة الترسيب في المختبر القائمة على concanavalin A لقياس تقارب الارتباط لفوسفاتاز الجلوكان مقابل ركائز STA المختلفة. المعلومات التي نكتسبها من هذه الطريقة أساسية لفهمنا لعائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكانية. تفاعلات بروتين الكربوهيدرات ضعيفة نسبيا ، وبالتالي لا يمكن للطرق الحالية اكتشاف تفاعلات الفوسفاتيز والجلوكان الجلوكان.

يمكن لمقايسة الترسيب القائمة على الليكتين أن تكتشف تقارب الارتباط في نطاق المليمول. يوضح توصيف طفرات SEX4 بالإضافة إلى أعضاء آخرين في عائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكان قدرة هذا الفحص على تحديد تفاعلات الكربوهيدرات البروتينية. أحد أكثر الأجزاء تحديا في الفحص هو تحسين نطاق تركيز الركيزة.

نوصي بالبدء بنطاق أوسع للحصول على فكرة ثم تضييق نطاق معين. للبدء ، ماصة 250 ميكرولتر من حبات ConA-sepharose معلقة في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي محتويات في 10،000 غرام لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية.

بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 750 ميكرولترا من المخزن المؤقت للربط إلى كل أنبوب يحتوي على 250 ميكرولتر من حبات ConA-sepharose. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 10،000 غرام لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية وإزالة طف. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيفات مزدوجة من محلول الأميلوبكتين القابل للذوبان لصنع سلسلة من محاليل الأميلوبكتين المخففة بملليلتر.

لتحضير حبات الأميلوبكتين ConA-sepharose ، أضف 250 ميكرولترا من كل محلول أميلوبكتين مخفف إلى الأنابيب التي تحتوي على 250 ميكرولتر من حبات ConA-sepharose العازلة المتوازنة والملزمة. امزج المحتويات جيدا وقم بتسمية الأنابيب بتركيز الأميلوبكتين المقابل. احتضان محتويات الأنبوب على عجلة دوارة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي للأنابيب عند 10،000 جم لمدة دقيقة واحدة.

امزج 250 ميكرولترا من حبات الأميلوبكتين ConA-sepharose مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط الذي يحتوي على 10 ميكروغرام من النشا الزائد أربعة ، أو بروتين SEX4 ، و 10 ملليمولار من ديثيوثريتول ، و 10 ميكرومولار من كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني. احتضان المحتويات عند أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة مع دوران لطيف. ثم أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 10،000 G لمدة دقيقة واحدة وبعناية ماصة 50 ميكرولتر من طاف في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر الطرد المركزي microcentritailt.

أضف 20 ميكرولترا من صبغة صفحة 4X SDS و 10 ميكرولترات من الماء المقطر إلى كل أنبوب يحتوي على 50 ميكرولترا من الكسور الطافية المجمعة وقم بتسميتها على أنها S.وبالمثل ، أضف 20 ميكرولترا من صبغة صفحة 4X SDS و 80 ميكرولترا من الماء المقطر في الأنابيب التي تحتوي على حبات ConA-sepharose amylopectin SEX4 المغسولة. بعد إضافة الصبغة والماء ، سخني جميع العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بمجرد طرد حبات ConA-sepharose amylopectin SEX4 بالطرد المركزي عند 10،000 جم لمدة دقيقة واحدة ، احفظ المادة الطافية وقم بتسميتها على أنها P.Load 40 ميكرولترا من عينات البروتين غير المنضمة المسمى S في 4 إلى 12٪ آبار جل بولي أكريلاميد مسبقة الصب من أدنى تركيز للركيزة إلى الأعلى ، مع الاحتفاظ بالممر الأول لعلامة الوزن الجزيئي للبروتين.

استخدم هلاما ثانيا لتحميل عينات البروتين المرتبطة بالجلوكان المسمى P.أضف صفحة SDS المعدة حديثا لتشغيل المخزن المؤقت لكلا حجرتي الجهاز وقم بتشغيل الجل عند 150 فولت لمدة 35 دقيقة أو حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع الجل. ثم خذ كاسيت الجل من الجهاز وقم بإزالة الفواصل والألواح الزجاجية لفصل الجل لتحليل اللطخة الغربية. اصنع لترا واحدا من المخزن المؤقت للنقل يحتوي على 5.8 جرام من قاعدة تريس ، و 2.9 جرام من الجلايسين ، و 0.37 جرام من SDS ، و 200 ملليلتر من الميثانول.

لنقل حجم البروتينات المنفصلة من هلام بولي أكريلاميد إلى غشاء النيتروسليلوز ، قم بتجميع الإسفنج وأوراق الترشيح والهلام وغشاء النيتروسليلوز وفقا لبروتوكول النقل الغربي وتشغيله عند 70 فولت لمدة ساعة واحدة. بعد تشغيل الجل ، احتضان غشاء النيتروسليلوز في محلول بروتين من 1 إلى 5٪ من ألبومين مصل الأبقار أو بروتين الحليب في 50 ملليلتر من المخزن المؤقت TBST لمدة ساعة واحدة لمنع ارتباط البروتين غير المحدد. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت TBST لإزالة أي محلول مانع غير منضم.

بعد ذلك ، احتضان الغشاء لمدة ساعة واحدة مع الجسم المضاد المرتبط ببيروكسيديز الفجل المخفف المحدد للبروتين الموسوم بالهستدين. ثم اغسل الغشاء ثلاث مرات في المخزن المؤقت TBST لإزالة أي أجسام مضادة غير منضمة. للتصوير الرقمي ، اصنع محلولا من أجزاء متساوية من محاليل الركيزة الكيميائية ، 750 ميكرولترا لكل منها في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، واحتضان الغشاء لمدة خمس دقائق على الأقل في المحلول.

ضع جانب البروتين الغشائي لأسفل على ماسح اللطخة وقم بتشغيل برنامج الاستحواذ لتحديد كمية البروتين في كل من الكسور الحبيبية والأجزاء الطافية. للحصول على البيانات ، ابدأ قياسات الإشارة الكمية باستخدام برنامج الاستحواذ مع ماسح اللطخة. تطبيع جميع القياسات الكمية في الأجزاء الطافية والحبيبات إلى إجمالي البروتين المحمل.

في تجربة الربط المشبعة ، ارسم النسبة المئوية للبروتين المرتبط مقابل تركيز الأميلوبكتين وتناسب البيانات باستخدام برنامج تحليل البيانات لحساب ثابت التفكك ، Kd.تم تحليل قدرة ربط SEX4 بحبات الأميلوبكتين ConA-sepharose باستخدام صفحة SDS. لوحظ وجود بروتين SEX4 في جزء الحبيبات وألبومين مصل الأبقار في الجزء الطافي. ظهر W278A ، وهو متحولة SEX4 معروفة مع قدرة ربط جلوكان منخفضة بشكل كبير ، في الجزء الطافي ، مما يشير إلى فائدة وخصوصية هذا الفحص.

كشف تحليل النشاف الغربي عن زيادة كبيرة في الكشف عن SEX4 والطريقة محددة للكشف عن فوسفات الجلوكان بعلامة الهستيدين الطرفية. تم اختبار مقايسة الترسيب بثلاثة تركيزات مختلفة من SEX4. في حين أن ميكروغرام من SEX4 يكفي للتصور من خلال الكشف عن التلألؤ الكيميائي ، فإن استخدام خمسة أو 10 ميكروغرام من SEX4 يسمح باكتشاف أكثر دقة.

أيضا ، لوحظ زيادة ارتباط SEX4 مع زيادة تركيز الأميلوبكتين. تم تحديد تقارب الارتباط للأميلوبكتين والبروتين البري SEX4 بتركيزات مختلفة وأعطت بيانات النسبة المئوية المرتبطة بالبروتين لنموذج ربط موقع واحد محدد Kd حوالي 1.03 ملليغرام لكل ملليلتر. تم تقييم قابلية تطبيق هذه الطريقة لقياس ارتباط اللافورين و LSF2 والذرة SEX4 والبطاطس SEX4 ضد أميلوبكتين البطاطس.

أظهرت النتائج أن البروتينات المختبرة من المحاصيل المهمة زراعيا مرتبطة أيضا بشكل تفاضلي بالأميلوكتين. من الأهمية بمكان أن نتذكر تطبيع جميع القياسات الكمية في الحبيبات والكسور الطافية إلى إجمالي البروتين المحمل. للتأكد من أن كل الأميلوبكتين مرتبط بالخرز ، احفظ الكسور الطافية لإجراء فحص الجلوكوز العميق لاحقا.

يستخدم فوسفاتيز الجلوكان آليات متميزة لربط الكربوهيدرات وتحديد موقعها وإزالة الفسفرة. تسمح هذه الطريقة باستكشاف ارتباط فوسفاتيز الجلوكان بمجالات هيكلية مختلفة داخل معقدات بوليمرية كبيرة لإزالة الفسفرة الخاصة بالموضعي.