تبلور البروتين عالي الإنتاجية عن طريق غسيل الكلى

التبلور عن طريق غسيل الكلى هو طريقة غير مستغلة. يقدم هذا البروتوكول نهج Novo لهذا ، مما سيزيد من نطاق استراتيجيات التبلور المتاحة حاليا للتحديد المنظم. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها عالية الإنتاجية وسهلة الإعداد دون الحاجة إلى معدات متخصصة ، وتسمح بمراقبة نمو البلورات بسهولة.

يجب أن يكون الفرد الذي يقوم بهذه التقنية مرتاحا للسحب منخفض الحجم واستخدام الماصات متعددة القنوات. يجب سحب القطرات بأكبر قدر ممكن لمنع الجفاف الجزئي. لإعداد تجربة غسيل الكلى ، ضع لوحة غسيل الكلى الدقيقة 96 بئرا المتاحة تجاريا في اتجاه جانب البروتين لأعلى وقم بإزالة شريط الغطاء اللاصق عن طريق تقشير فاصل لاصق الضغط 200 ميكرون.

بعد تقشير شريط الغطاء اللاصق ، لاحظ موضع البئر A1. بعد ذلك ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتحميل 3.2 ميكرولتر كحد أقصى من عينة البروتين المعدة بشكل صحيح في كل بئر. ضع فيلم غطاء الأشعة فوق البنفسجية 200 ميكرون بشكل صحيح فوق لوحة 96 بئرا مع توجيه الفيلم لأعلى. بعد ذلك ، لتنشيط لاصق الضغط وإغلاقه ، اضغط لأسفل على فيلم غطاء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مجداف مانع للتسرب وتحقق من سلامته.

الآن ، اقلب اللوحة لإحضارها إلى اتجاه الجانب العازل لأعلى ولاحظ الموضع المعكوس للبئر A1 المحدد. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتحميل 350 ميكرولتر كحد أقصى من محلول غسيل الكلى في كل بئر من اللوحة وأغلق الآبار بعناية باستخدام فيلم غطاء الخزان. بعد ذلك ، ضع اللوحة في الاتجاه الجانبي العازل لأعلى داخل حاضنة مناسبة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 20 درجة مئوية للسماح بنمو البلورات. لفحص تكوين البلورة تحت المجهر ، قم بإزالة فيلم الغطاء الواقي من فيلم غطاء الأشعة فوق البنفسجية 200 ميكرون وضع اللوحة أسفل العدسة بحيث يكون جانب البروتين متجها لأعلى.

لإعداد تجربة تبلور واسعة النطاق ، اعتمد الظروف التي حدث فيها نمو بلوري دقيق في لوحة غسيل الكلى الدقيقة وتكرار نفس الظروف في حاويات كبيرة. حدد حجم الحاوية حسب حجم محلول غسيل الكلى. ماصة بحد أقصى 500 ميكرولتر من عينة البروتين في أنبوب غسيل الكلى قبل إغلاق الأنبوب باستخدام الغطاء البلاستيكي الأحمر.

ضع أنبوب غسيل الكلى المختوم سعة 500 ميكرولتر في الرف العائم داخل الحاوية المملوءة بمحلول غسيل الكلى. بعد ذلك ، ضع الحاوية دون عائق داخل حاضنة مناسبة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 20 درجة مئوية لتحقيق نمو بلوري. للتحقق من تكوين البلورات ، ماصة واحد إلى اثنين ميكرولتر من المحلول من جهاز غسيل الكلى على شريحة غطاء زجاجي.

قم بتغطية المحلول الموجود على الشريحة بشريحة زجاجية أخرى واعرضه تحت المجهر. أظهرت الصور التي تم التقاطها باستخدام مجهر ستيريو عالي التكبير تكوينا بلوريا دقيقا ناجحا لأربعة بروتينات باستخدام ألواح غسيل الكلى الدقيقة مع أغشية قطع الوزن الجزيئي 10 كيلو دالتون. وجد أن الليزوزيم يشكل بلورات عند تحليله ضد 0.1 مولار أسيتات الصوديوم عند الرقم الهيدروجيني 4 الذي يحتوي على إضافات مناسبة.

شكل دوماتين بلورات عند تحليله ضد 0.1 موليس بيس تريس البروبان عند درجة الحموضة 6.6 التي تحتوي على إضافات مناسبة. أدت ظروف غسيل الكلى المحسنة إلى تكوين بلورات دقيقة بواسطة بروتينات الغشاء ، وهي بروتين مضخة تدفق E.coli متعدد الأدوية AcrB وناقل اللاكتوز E.coli LacY. أدى التبلور على نطاق واسع في أنابيب غسيل الكلى باستخدام ظروف غسيل الكلى المحسنة التي تم الحصول عليها من تجارب غسيل الكلى الدقيقة إلى تكوين الآلاف من البلورات الدقيقة لكل من البروتينات.

لبلورة الفوميتين ، تم غسيل 250 ميكرولتر من البروتين مقابل 50 ملليلتر من محلول غسيل الكلى. بالنسبة إلى AcrB ، تم تحليل 250 ميكرولترا من البروتين مقابل 25 ميكرولترا من محلول غسيل الكلى. كما تم إعداد تبلور LacY بنفس النسبة ، مع 100 ميكرولتر من البروتين إلى 10 ملليلتر من محلول غسيل الكلى.

عند قلب اللوحة إلى جانب المخزن المؤقت لأعلى ، من المهم ملاحظة موضع A1 ، بحيث يمكن الاستغناء عن المحاليل من شاشة التبلور وفقا لذلك. يمكن استخدام البلورات التي تم الحصول عليها من هذه الطريقة في تطبيقات المصب ، مثل علم البلورات التسلسلي والضعف الجنسي الدقيق.