Name: في المختبر التحقيق في آثار المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان على هجرة خلايا القمة العصبية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: اكتشف تقييم هجرة خلايا القمة العصبية في مصفوفة غنية بالهيالورونان خارج الخلية. تتيح هذه الطريقة دراسة الالتصاق والهجرة الخلوية وتسريع اكتشاف الأدوية المؤثرة في تحلل حمض الهيالورونيك.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

أعرب عن تقديري الكبير لفوميتوشي إيري ويو ياماغوتشي لتشجيعهما واقتراحاتهما الطيبة في إنشاء هذه الطريقة. تم دعم هذا العمل من خلال المنح المساعدة لبرامج البحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (#19KK0232 إلى TI ، #20H03896 إلى T.I.). تم وصف الطريقة الأصلية لطلاء HA على ركائز زجاجية ومقايسات تحلل HA في الموقع على الركائز في Yamamoto et al. (2017) 8 ، بينما تم وصف طريقة تحضير ركائز HA / Col1 المختلطة في Irie et al. (2021) 7.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في كلية الدراسات العليا لطب الأسنان بجامعة أوساكا.
1. ثقافة خلايا قمة الجمجمة العصبية الفأر
ملاحظة: يتكون خط خلايا القمة العصبية المستخدم في هذه الدراسة من خلايا O9-1 ، المشتقة أصلا من Wnt1-Cre. الخلايا المعبرة عن R26R-GFP المعزولة من أجنة الفئران E8.512 (انظر المناقشة). تتبع الطريقة الموضحة هنا لزراعة خلايا O9-1 البروتوكول13 الذي تم إنشاؤه مسبقا.
<ol><li>تحضير لوحة مصفوفة الغشاء القاعدي.<ol><li>قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) على الجليد. تمييع المصفوفة 1:50 في 1x PBS المبردة ، والحفاظ على الجليد.</li>
		<li>قم بتغطية صفيحة استزراع 10 سم ب 10 مل من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، ونضح المصفوفة قبل الاستخدام.</li>
		<li>اغسل الطبق 3x مع 2 مل من PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>ثقافة خلايا O9-1 على لوحة مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي.<ol><li>قم بتسخين وسط الخلية الجذعية الجنينية الكاملة (انظر جدول المواد) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.</li>
		<li>امزج تعليق الخلية O9-1 برفق (انظر جدول المواد) واحسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي (انظر جدول المواد). اضبط تركيز الخلية على 1.1 × 106 / مل باستخدام وسيط خلية ES كامل.</li>
		<li>أضف 8 مل من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل الذي تم تسخينه مسبقا إلى صفيحة الاستزراع 10 سم المطلية بالمصفوفة ، وقم بزرع خلايا O9-1 عند 1.1 × 106 خلايا / لوحة. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة 5٪ CO2 .</li>
		<li>في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط خلية ES كامل جديد (تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية). استبدله بوسط طازج كل 2-3 أيام بعد ذلك. ملاحظة: عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ تقريبا (3-4 أيام بعد الطلاء) ، يمكن فصلها بنسبة 0.25٪ من التربسين-EDTA وتمريرها أكثر أو تجميدها لاستخدامها لاحقا. يوضح الشكل 1 صورا تمثيلية لخلايا O9-1.</li>
		<li>اغسل طبق الاستزراع ب 2 مل من 1x PBS قبل التربسين. يضاف 2 مل من التربسين-EDTA المسخن مسبقا بنسبة 0.25٪ ويحتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق من انفصال الخلية الكامل ؛ اضغط برفق على جانب اللوحة عدة مرات إذا لزم الأمر.</li>
		<li>أضف 2 مل من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل الذي تم تسخينه مسبقا إلى لوحة المزرعة وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>تخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. بعد ذلك ، أضف 2 مل من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل الذي تم تسخينه مسبقا إلى الأنبوب ، وأعد تعليق الخلايا تماما عن طريق الماصة. زرع الخلايا على لوحة استزراع جديدة بكثافة الخلية المطلوبة.</li>
		<li>بدلا من ذلك ، قم بإعداد مخزون الخلايا المجمدة عن طريق إضافة 1 مل من وسط تجميد الخلايا الذي يحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى الأنبوب بدلا من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل وإعادة تعليق الخلايا تماما. انقل تعليق الخلية إلى أنابيب التبريد ، واحفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.</li>
	</ol></li>
</ol>2. تحضير الطبق المطلي ب HA / Col1
ملاحظة: تم اقتراح الطريقة الأصلية لطلاء HA / Col1 على أطباق ذات قاع زجاجي بواسطة Irie et al.7.
<ol><li>أضف بعناية 50 ميكرولتر من ثلاثي إيثوكسيسيلان غير المخفف إلى طبق ذو قاع زجاجي 3.5 سم (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) وحفظه بعيدا عن الضوء. ملاحظة: يجب ألا تتجاوز الحضانة مع ثلاثي إيثوكسيسيلان 5 دقائق. قد يؤثر ذلك على كفاءة الطلاء وينتج منتجات غير مرغوب فيها.</li>
	<li>اغسل الطبق بسرعة 3 مرات مع 2 مل من الماء المقطر. أضف 50 ميكرولتر من 0.25٪ جلوتارالدهيد ، مخفف 100x في برنامج تلفزيوني ، لكل طبق ، واحتضانه في RT لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>اغسل بسرعة 4x مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. ثم قم بتغطية الأطباق ب 300 ميكرولتر من الكولاجين من النوع الأول في 0.2 N حمض الخليك في RT لمدة 1 ساعة.</li>
	<li>يغسل بسرعة 3x مع 2 مل من PBS. أضف 300 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل من هيالورونات الصوديوم H2 (FAHA-H2) المسمى بالفلوريسينامين (المخفف في PBS) إلى كل طبق واحتضانه طوال الليل في RT. اغسل مرة أخرى 3x مع 2 مل من PBS. بعد استنشاق برنامج تلفزيوني ، جفف اللوحة بالهواء لمدة 5 دقائق على مقعد نظيف. ملاحظة: FAHA-H2 عبارة عن هيالورونات الصوديوم المسمى بالفلورسينامين بمتوسط وزن جزيئي يتراوح بين 1200-1600 كيلو فولت أمبير. يمكن استخدام HA ذو الوزن الجزيئي المناسب وفقا لتصميم البحث.</li>
</ol>3. مقايسة الهجرة على الطبق المطلي ب HA / Col1
ملاحظة: تم إجراء اختبار قائم على إغلاق الجرح باستخدام فجوات خالية من الخلايا 500 ميكرومتر محددة في ركائز Col1 / HA باستخدام إدخالات ثقافة بئرين (انظر جدول المواد). تعبر خلايا O9-1 عن Tmem2 ، وهو أمر مطلوب لالتصاق وتدهور HA في الفضاء خارج الخلية9 (الشكل 2 والشكل 3).
<ol><li>بعد تجفيف الطبق ذو القاع الزجاجي المطلي ، قم بتوصيل إدخالات الثقافة 2-well بالأطباق ، واملأ الإدخالات خارجيا ب 1 مل من PBS.</li>
	<li>قم بزرع خلايا O9-1 في الآبار عند 1 × 104 خلايا في 100 ميكرولتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) لكل إدخال. استزراع الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 .</li>
	<li>قم بإزالة الحشوات بعناية من الأطباق ذات القاع الزجاجي المطلي بالملاقط. اغسل الأطباق ذات القاع الزجاجي المطلي برفق باستخدام 2 مل من 1x PBS لإزالة الخلايا وحطام الخلايا. أضف 2 مل من DMEM الطازج الذي يحتوي على 2٪ FBS إلى أطباق الاستزراع.</li>
	<li>التقط صورا بتباين الطور الآن كنقطة زمنية للبدء باستخدام مجهر مضان الكل في واحد في وضع أحادي اللون مع إعدادات عالية الدقة (كسب عند 6 ديسيبل ، بدون تجميع). تم استخدام العدسات الموضوعية ذات التكبير من 4x إلى 20x للتصوير في هذه الدراسة (انظر جدول المواد). ملاحظة: التقط صور تباين الطور باستخدام أشرطة المقياس المقابلة واحفظها بتنسيق TIFF.</li>
	<li>استزرع الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. التقط صورا بتباين الطور عند 24 ساعة و 48 ساعة في الثقافة باستخدام مجهر مضان الكل في واحد.</li>
	<li>ثبت الخلايا عند 48 ساعة باستخدام 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. ثم اغسل الأطباق 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1 مل من برنامج تلفزيوني طازج.</li>
	<li>ضع غطاء مع وسيط تثبيت (انظر جدول المواد) لمزيد من المراقبة المورفولوجية. ملاحظة: يمكن تصوير الأطباق على الفور أو تخزينها لمدة تصل إلى 2 أشهر عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>اختياري: تسمية الخلايا المناعية للبروتينات ذات الأهمية. ملاحظة: يوصف هنا كمثال بروتوكول للكشف عن مركب الالتصاق البؤري (FA) باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مشتق من الفأر (انظر جدول المواد).<ol><li>احتضن الأطباق (من الخطوة 3.6) ب 0.5 مل من العازلة المانعة (5٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني) لمدة 60 دقيقة. ملاحظة: اختر حاجزا مناسبا للحظر للجسم المضاد الأساسي. سيكون المخزن المؤقت النموذجي للحجب هو مصل طبيعي بنسبة 5٪ من نفس النوع مثل الجسم المضاد الثانوي المستخدم.</li>
		<li>تحضير الجسم المضاد الأولي المخفف في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (1٪ مصل الماعز الطبيعي في برنامج تلفزيوني). احتضان الأطباق مع 0.5 مل من الأجسام المضادة الأولية المخففة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: اختر المخزن المؤقت المناسب لتخفيف الأجسام المضادة. عادة ، يتم استخدام الجسم المضاد في تخفيف 1: 50-1: 200.</li>
		<li>شطف 3x لمدة 5 دقائق لكل منها مع 2 مل من PBS. قم بإعداد الجسم المضاد الثانوي المخفف المشتق من الماعز المضاد للفأر في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (1٪ مصل الماعز الطبيعي في برنامج تلفزيوني). احتضان الأطباق مع 0.5 مل من الأجسام المضادة الثانوية المخففة لمدة 1-3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: عادة ، يتم استخدام الجسم المضاد الثانوي عند تخفيف 1: 500-1: 1,000. يمكن استخدام DAPI لتلطيخ النوى.</li>
		<li>شطف 3x مع 2 مل من PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة. ضع غطاء الغطاء مع 50 ميكرولتر من وسيط التثبيت. ملاحظة: يمكن تصوير الأطباق باستخدام المجهر الفلوري الكل في واحد مع مرشح GFP (الإثارة: 470/40 ، الانبعاث: 525/50) ومرشح TexasRed (الإثارة: 560/40 ، الانبعاث: 630/75) في وضع أحادي اللون مع إعدادات عالية الدقة (كسب عند 6 ديسيبل ، بدون تجميع). تم استخدام عدسات موضوعية ذات تكبير من 4x إلى 20x للتصوير في هذه الدراسة. ملاحظة: يمكن تخزين الشريحة لمدة تصل إلى 2 أشهر عند 4 درجات مئوية.</li>
	</ol></li>
</ol>4. تحليل البيانات
<ol><li>افتح برنامج ImageJ 1.51s. في نافذة ImageJ، حدد ملف > فتح من شريط القائمة لفتح ملف الصورة المحفوظ.</li>
	<li>لضبط مقياس القياس ، ارسم خطا بنفس مسافة شريط المقياس. انتقل إلى تحليل > تعيين مقياس واكتب المسافة والوحدات المعروفة للخط في المربعات المناسبة في نافذة تعيين المقياس .</li>
	<li>ارسم خطا مستقيما بين فجوة الخلية، واضغط على تحليل > قياس لنقل القيم إلى نافذة بيانات. قم بقياس خمسة مواضع مختلفة على الأقل في كل عينة ، وقم بحساب متوسط المسافات للحصول على بيانات العينة التمثيلية. إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام البرامج المناسبة (انظر جدول المواد).</li>
</ol>

<ol><li>Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+switches+in+mammalian+neural+crest+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).</li>
<li>Casini, P., Nardi, I., Ori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+is+required+for+cranial+neural+crest+cells+migration+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development.</a> Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).</li>
<li>Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versican+is+selectively+expressed+in+embryonic+tissues+that+act+as+barriers+to+neural+crest+cell+migration+and+axon+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth.</a> Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).</li>
<li>Camenisch, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+hyaluronan+synthase-2+abrogates+normal+cardiac+morphogenesis+and+hyaluronan-mediated+transformation+of+epithelium+to+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).</li>
<li>Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-valve+mesenchyme+formation+is+dependent+on+hyaluronan-augmented+activation+of+ErbB2-ErbB3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors.</a> Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).</li>
<li>Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hyaluronan+synthase-2+in+craniofacial+and+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development.</a> Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).</li>
<li>Irie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+hyaluronidase+TMEM2+regulates+cell+adhesion+and+migration+via+degradation+of+hyaluronan+at+focal+adhesion+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100481(2021).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+homolog+of+the+zebrafish+transmembrane+protein+2+%28TMEM2%29+is+the+long-sought-after+cell-surface+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).</li>
<li>Inubushi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+hyaluronidase+TMEM2+plays+an+essential+role+in+mouse+neural+crest+cell+development+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival.</a> PLoS Genetics. 18 (7), 1009765(2022).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51046(2014).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+manipulation+of+O9-1+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Humphries, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinculin+controls+focal+adhesion+formation+by+direct+interactions+with+talin+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).</li>
<li>Perris, R., Perissinotto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+during+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration.</a> Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).</li>
<li>Perris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+changes+in+the+distribution+of+proteoglycans+during+avian+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development.</a> Development. 111 (2), 583-599 (1991).</li>
<li>Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decorin+developmental+expression+and+function+in+the+early+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decorin developmental expression and function in the early avian embryo.</a> The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).</li>
<li>Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+avian+neural+crest+cell+migration+on+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin.</a> Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).</li>
<li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+tissue+mechanical+properties+affect+enteric+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration.</a> Scientific Reports. 6, 20927(2016).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+and+Migration%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+methods+for+cell-cycle+synchronization+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells.</a> Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).</li>
<li>Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+T+lymphocyte+adhesion+receptor+for+an+alternative+cell+attachment+domain+%28CS-1%29+in+plasma+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).</li>
<li>Robert, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+3-aminopropyltriethoxysilane+layers+formed+on+silanol-terminated+silicon+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces.</a> The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).</li>
</ol>

ويعلن صاحب البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.

تنظم مكونات ECM المختلفة الهجرة / الهجرة NCC. على سبيل المثال ، ينظم HA بشكل إيجابي ترحيل NCC 2,15. ومن المثير للاهتمام ، أن دراسة تستند إلى نماذج الفئران الجينية ل Tmem2 ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، أوضحت متطلبات تدهور HA في هجرة NCC9. الكولاجين وفير أيضا في ECM المحيط بالأنبوب العصبي16. ثبت أن Decorin ، وهو بروتيوغليكان صغير غني بالليوسين ، ينظم هجرة NCC أثناء التطور العصبي17. تؤثر مكونا...

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة خلايا متعددة القدرات موجودة في الأجنة النامية ، وتنشأ من حدود الصفيحة العصبية أثناء العصبية. أنها تسهم في تشكيل مجموعة متنوعة من الأنسجة ، بما في ذلك الجهاز العصبي المحيطي ، ونظام القلب والأوعية الدموية ، والأنسجة القحفية الوجهية ، والهيكل العظمي1. بعد الحث ومواصفات NCC على حدود الصفيحة العصبية ، تهاجر NCCs من الظهارة العصبية وتهاجر نحو مواقع الأنسجة المشتقة من NCC1.
الهيالورونان (HA) هو جليكوزامينوجليكان غير كبريتي يتم توزيعه في مجموعة متنوعة من الأنسجة كمكون للمصفوفة خارج الخلية (ECM). تم إثبات أهمية HA في تطور الجنين في الأنظمة النموذجية من خلال استئصال الجينات المسؤولة عن استقلاب الهيالورونان. على سبيل المثال ، تم العثور على طفرات في جينات سينسيز الهيالورونان (Has1 و Has2) في Xenopus تؤدي إلى عيوب هجرة NCC والتشوه القحفيالوجهي 2. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن البروتيوغليكان المرتبط ب HA ، aggrecan و versican ، يمارس تأثيرات مثبطة على هجرة NCC3. في الفئران ، يؤدي الاجتثاث Has2 إلى عيوب شديدة في تكوين وسادة الشغاف ، مما يؤدي إلى فتك منتصف الحمل (E9.5-10)4،5،6.
ثبت مؤخرا أن البروتين عبر الغشاء 2 (Tmem2) ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، يلعب دورا مهما في تعزيز التصاق الخلايا السرطانية بوساطة الأنتغرين وهجرتها عن طريق إزالة HA المرتبط بالمصفوفة في مواقع الالتصاق 7,8. في الآونة الأخيرة ، أظهر Inubushi et al.9 أن نقص Tmem2 يؤدي إلى عيوب قحفية وجهية شديدة بسبب تشوهات في هجرة / هجرة NCC والبقاء على قيد الحياة. في الدراسة السابقة9 ، تم تحليل تعبير Tmem2 أثناء تكوين NCC والهجرة. لوحظ تعبير Tmem2 في موقع تفريغ NCC وفي هجرة NCCs الإيجابية Sox9 (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام خلايا القمة العصبية للفأر المستنفد Tmem2 O9-1 ، أظهرت الدراسة أن التعبير في المختبر ل Tmem2 كان ضروريا لخلايا O9-1 لتشكيل التصاقات بؤرية وهجرتها إلى ركائز تحتوي على HA (الشكل 2 والشكل 3) 9.
تشير هذه النتائج بقوة إلى أن Tmem2 مهم أيضا لالتصاق NCC والانتقال من خلال ECM الغني ب HA. ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية لالتصاق NCC والهجرة داخل ECM الغنية ب HA لا تزال غير واضحة. لذلك ، من الضروري إنشاء نظام تجريبي للثقافة في المختبر لاستكشاف التصاق NCC والهجرة بشكل كامل داخل ECM الغني ب HA.
من بين الأساليب العديدة المستخدمة في اختبار هجرة الخلايا ، فإن الفحص القائم على إغلاق جرح الخلية هو طريقة بسيطة تستخدم بشكل متكرر في مجالات علم وظائف الأعضاء والأورام10. هذا النهج مفيد بسبب صلته بالنمط الظاهري في الجسم الحي وهو فعال في تحديد أدوار الأدوية والجاذبات الكيميائية أثناء هجرة الخلايا11. من الممكن تقييم قدرة الهجرة لكل من كتل الخلايا الكاملة والخلايا الفردية عن طريق قياس مسافات فجوة الخلية بمرور الوقت11. في هذه المخطوطة ، تم تقديم اختبار معدل قائم على إغلاق الجروح في المختبر لنموذج هجرة NCC إلى الأنسجة الغنية ب HA المحيطة بالأنبوب العصبي. ينطبق هذا الإجراء أيضا على دراسة مكونات ECM المختلفة (مثل الكولاجين والفبرونيكتين واللامينين) لتحليل دور سقالة ECM في هجرة NCC.

<table><tbody><tr><td>طبق ثقافة الخلايا 10 سم</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. لا. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>2-well culture inserts</td><td>ibidi</td><td>Cat. رقم 80209</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 علامة الماعز المضادة للفأر IgG</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. A21422</td><td>الماعز مشتق من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر</td></tr><tr><td>عداد الخلايا الآلي</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. لا. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>CAT. 11910</td><td>خلية تجميد</td></tr><tr><td>متوسط الكولاجين من النوع الأول</td><td>سيجما</td><td>كات. رقم 08-115</td><td></td></tr><tr><td>خلية ES كاملة متوسطة</td><td>Millipore</td><td>Cat. لا. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco ' s معدل النسر المتوسط&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>Cat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنين</td><td>Gibco</td><td>Cat. 10270106</td><td></td></tr><tr><td>المجهر الفلوري</td><td>Keyence</td><td>Cat. لا. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresent المسمى HA</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>Glas الطبق السفلي</td><td>Iwaki</td><td>Cat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>الجلوتالديهايد</td><td>سيجما</td><td>كات. رقم G5882</td><td></td></tr><tr><td>ماتريجل</td><td>فيشر</td><td>كات. لا. CB-40234</td><td>مصفوفة الغشاء القاعدي</td></tr><tr><td>أحادية النسيلة المضادة للفينكولين الأجسام المضادة</td><td>Sigma</td><td>Cat. لا. V9264</td><td></td></tr><tr><td>تصاعد وسائل الإعلام</td><td>داكو</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>مصل الماعز العادي</td><td>فيشر</td><td>كات. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 خلايا</td><td>ميليبور</td><td>القط. لا. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهايد</td><td>سيجما</td><td>القط 158127</td><td></td></tr><tr><td>ثلاثي إيثوكسيسيلان</td><td>سيجما</td><td>كات. رقم 390143</td><td></td></tr><tr><td>التربسين EDTA</td><td>ميليبور</td><td>كات. لا. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

في المختبر التحقيق في آثار المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان على هجرة خلايا القمة العصبية

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تنشأ من المنطقة الظهرية للأنبوب العصبي. تعد هجرة الخلايا الخيطية من الأنبوب العصبي عملية أساسية لإنتاج NCC وهجرتها اللاحقة نحو المواقع المستهدفة. يتضمن مسار هجرة NCCs ، بما في ذلك أنسجة الأنبوب العصبي المحيطة ، مصفوفة خارج الخلية غنية بالهيالورونان (HA). لنمذجة هجرة NCC إلى هذه الأنسجة المحيطة الغنية ب HA من الأنبوب العصبي ، تم إنشاء اختبار هجرة الركيزة المختلطة الذي يتكون من HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 kDa) والكولاجين من النوع الأول (Col1) في هذه الدراسة. يوضح اختبار الهجرة هذا أن خلايا خط خلايا NCC ، O9-1 ، مهاجرة للغاية على الركيزة المختلطة وأن طلاء HA يتحلل في موقع الالتصاقات البؤرية أثناء الهجرة. يمكن أن يكون هذا النموذج في المختبر مفيدا لمزيد من الاستكشاف للأساس الميكانيكي الذي ينطوي عليه هجرة NCC. ينطبق هذا البروتوكول أيضا على تقييم ركائز مختلفة كسقالات لدراسة هجرة NCC.

تم إجراء اختبار الهجرة على ركائز مختلطة تتكون من Col1 والوزن الجزيئي العالي HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 كيلو دالتون) باستخدام البروتوكول الموضح هنا. تم العثور على خلايا O9-1 عند حدود الفجوة تهاجر بسهولة إلى الفجوة الغنية ب HA (الشكل 4). أكد التلوين المناعي لعلامة FA ، vinculin14 ، أن خلايا O9-1 شكلت التصاقات بؤرية (FAs) في مواقع تدهور HA (الشكل 5).
<img alt="F...

يحدد هذا البروتوكول تجربة الهجرة في المختبر المناسبة للتحليل الوظيفي للجزيئات المشاركة في الهجرة في الجسم الحي لخلايا القمة العصبية إلى المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان.

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

حمض الهيالورونيك هو واحد من أكثر المصفوفة خارج الخلية وفرة في النموذج الحيواني. تم إثبات أهمية حمض الهيالورونيك في التطور الجنيني. هذا النموذج في المختبر مفيد لاستكشاف كيفية التصاق خلايا القمة العصبية وهجرتها داخل المصفوفة خارج الخلية الغنية بحمض الهيالورونيك.باستخدام تقنيتنا ، يمكننا تقييم الهجرة وقدرة تدهور HA لكل من السكان بالجملة ثم الخلايا الفردية بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لفحص الأدوية للعثور على مركب يسرع أو يمنع تدهور حمض الهيالورونيك. للبدء ، قم بتخفيف مصفوفة الغشاء القاعدي باستخدام PBS المبرد بنسبة 1:50 واحتفظ بها على الجليد.قم بتغطية صفيحة ثقافة 10 سم ب 10 ملليلتر من محلول المصفوفة المخفف واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اغسل الطبق ثلاث مرات بمليلتر من برنامج تلفزيوني. لزراعة الخلايا O9-1 على الصفيحة المطلية بالمصفوفة ، قم بتسخين الجذع الجنيني الكامل أو وسط الخلايا الجذعية الجنينية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.امزج تعليق الخلية O9-1 برفق واحسب عدد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي. ثم اضبط تركيز الخلية على 1.1 مليون خلية لكل مليلتر باستخدام وسيط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل. أضف ثمانية ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل المسخن مسبقا إلى صفيحة الاستزراع المطلية بالمصفوفة التي يبلغ طولها 10 سم وبذر خلايا O9-1 بمعدل 1.1 مليون خلية لكل لوحة.احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط خلية ES كامل جديد مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. استبدله بوسط طازج كل يومين إلى ثلاثة أيام بعد ذلك.اغسل طبق الاستزراع بمليلتر من PBS ثم أضف ملليلتر من 0.25٪ Trypsin-EDTA المسخن مسبقا. احتضان لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. أضف ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل المسخن مسبقا إلى لوحة الاستزراع وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.قم بطرد الأنبوب عند 300 جرام لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. أضف ملليلتر من وسيط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل المسخن مسبقا إلى الأنبوب وأعد تعليق الخلايا تماما عن طريق الماصة. ثم قم بزرع الخلايا على طبق استزراع جديد بكثافة الخلية المطلوبة.أضف بعناية 50 ميكرولترا من ثلاثي إيثوكسيسيلان غير المخفف إلى طبق سفلي زجاجي 3.5 سم واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. اغسل الطبق ثلاث مرات بمليلتر من الماء المقطر وأضف 50 ميكرولتر من 0.25٪ جلوتارالدهيد مخفف 100 مرة في برنامج تلفزيوني لكل طبق. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ثم اغسل أربع مرات مع ملليلتر من برنامج تلفزيوني وتغطي الأطباق مع 300 ميكرولتر من الكولاجين نوع واحد في 0.2 حمض الخليك العادي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.مرة أخرى ، اغسل ثلاث مرات مع ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف 300 ميكرولتر من 200 ميكروغرام لكل مليلتر فلورسينامين ، المسمى هيالورونات الصوديوم H2 إلى كل طبق واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. اغسل مرة أخرى مع ملليلتر من PBS ثلاث مرات.بعد تجفيف الطبق السفلي الزجاجي المطلي ، قم بتوصيل إدراجين لثقافة البئر بالأطباق واملأ الإدخالات خارجيا بمليلتر واحد من PBS. قم بزرع خلايا O9-1 في الآبار عند 10،000 خلية في 100 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني أو FBS لكل إدخال. قم بزراعة الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ ، والتقط صورا متباينة للمرحلة كنقطة زمنية للبدء ، باستخدام مجهر مضان الكل في واحد.قم بإزالة الحشوات بعناية من الأطباق السفلية الزجاجية المطلية بملاقط واغسل الأطباق السفلية الزجاجية المطلية برفق باستخدام ملليلتر من PBS لإزالة الخلايا وحطام الخلايا. أضف ملليلتر من DMEM الطازج الذي يحتوي على 2٪ FBS إلى الأطباق المستزرعة. قم بزراعة الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون والتقاط صور تباين الطور بعد 24 ساعة و 48 ساعة في الثقافة.اغسل الأطباق باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بإصلاح الخلايا بعد 48 ساعة باستخدام ملليلتر واحد من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الأطباق ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني طازج. أخيرا ، ضع زلة غطاء مع وسيط التثبيت لمزيد من المراقبة المورفولوجية.يظهر في هذا الشكل المقاطع المستعرضة للأنبوب العصبي لأجنة علم Tmem2 عند E9.0. تم تسمية الأقسام الموجودة على مستوى الجمجمة والجذع للأنبوب العصبي بعلامة مزدوجة لبروتين علم Tmem2 والهيالورونان. لوحظ تعبير Tmem2 في الصفيحة العصبية والمنطقة الحدودية للأنبوب العصبي بينما كانت هذه المواقع خالية من تلطيخ الهيالورونان.يتم عرض العلامات المزدوجة لخلايا القمة العصبية لعلم Tmem2 و Sox9 هنا. تم تلطيخ المقاطع المستعرضة للأنبوب العصبي E9.0 لعلم Tmem2 و Sox9. يوضح هذا الشكل الصور التمثيلية لخلايا Tmem2 المستنفدة وخلايا التحكم O9-1 المستزرعة على طبق استزراع عادي.تم تقييم تعبير Tmem2 في هذه الخلايا بواسطة qPCR مع GAPDH كعنصر تحكم داخلي للتطبيع. تم استزراع خلايا Tmem2 المستنفدة والسيطرة O9-1 لمدة 48 ساعة على زلات غطاء زجاجي مطلية بالهيالورونان المفلور. تم الكشف عن نشاط الهيالورونان المهين كمناطق مظلمة في الخلفية الفلورية.كما تمت مقارنة مستوى تحلل الهيالورونان كميا بين خلايا Tmem2 المستنفدة وخلايا التحكم O9-1. يظهر في هذا الشكل تدهور الهيالورونان المرتبط بالركيزة عند الالتصاقات البؤرية في خلايا O9-1. كانت خلايا O9-1 المزروعة على ركائز مختلطة تتكون من Col1 / HA موسومة بجسم مضاد للفينكولين.تمثل البقع أو الخطوط الداكنة نشاط تحلل الهيالورونان في ركيزة FAHA H2. تم تحديد مواقع تحلل الهيالورونان والالتصاقات البؤرية على الركائز المختلطة. يعد طلاء كوفال للأطباق ذات القاع الزجاجي ب HA خطوة حاسمة في البروتوكول لأن الطلاء غير الكافي يمكن أن يؤدي إلى إزالة HA بسهولة عن طريق القوة الميكانيكية أثناء الالتصاق والهجرة.لضمان الطلاء المناسب ، نستخدم الجلوتارالدهيد ، الكولاجين من النوع الأول المتجمد كيميائيا على الزجاج عن طريق اقتران التسليح بالألدهيد. من الممكن استخدام ركيزة مصفوفة خارج الخلية بجانب الكولاجين من النوع الأول ، ولكن يجب أن تحتوي على مجموعات تسليح وقد تكون هناك قيود في طلائها على أطباق القاع الزجاجي بسبب خصائصها الكيميائية. لذلك قد تكون التجربة والخطأ ضرورية لتحديد أفضل نهج.يمكن أن تكون هذه التجربة المعملية مفيدة في دراسة كيفية عمل جزيء معين أثناء حركة خلايا القمة العصبية في بيئة HA أو HA حول الأنبوب العصبي. يمكن أن يكون أيضا وسيلة مفيدة لاختبار الدواء الذي يمكن أن يسرع أو يمنع عملية الهجرة هذه. من المثير للاهتمام معرفة سبب امتلاك Tmem2 لوظائف الالتصاق على HA وتدهور HA ولماذا يجب تحلل HA في موقع التماسك الكامل.نظرا لأن HA هو المادة الأكثر شيوعا في المصفوفة خارج الخلية ، فإن معرفة إجابة هذا السؤال أمر مهم حقا في علم الأحياء والطب. هذا البروتوكول التجريبي ذو قيمة لأنه يمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الليفية الجلدية والخلايا الظهارية والخلايا السرطانية.

in-vitro-investigation-effects-hyaluronan-rich-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

علينا أن نظهر أن التعبير أكثر من البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) يعزز حركية من خلايا الجذعية العصبية (NSCs) باستخدام agarose هلام رواية الجهاز ميكروفلويديك القائمة. يمكن أن تكون قابلة للتكيف هذه التكنولوجيا بسهولة لغيرها من نظم خلايا الثدييات الخلية حيث قالت مصادر شحيحة ، مثل الخلايا الجذعية العصبية ، وبدوره حولها الساعة الحرجة.

تقييم العصبية على الحركة باستخدام الخلايا الجذعية جل المستندة Agarose الأجهزة ميكروفلويديك

وقت التصوير انقضاء زراعة الأنسجة 3D يسمح بدراسة سلوك الهجرة من الخلايا الفردية النابعة من سماحة العقدية كرد فعل لاستخراج البروتين مجزأة من القشرة الدماغية.

المهاجرة سلوك الخلايا المولدة في الثقافات سماحة العقدية

يوصف هذا النهج لتحليل الهجرة من الخلايا explanted (خلايا الجذع قمة العصبية). هذه الطريقة غير مكلفة، لطيف، وقادرة على التمييز الكيميائي من كلا تنشيط كيميائي والتأثيرات الأخرى على الاستقطاب المهاجرة مثل تلك المشتقة من خلية خلية التفاعلات داخل الجذع العصبية الأولية قمة الثقافة الخلية.

تحليل العصبية كريست الهجرة جذع الخلية باستخدام التعديل الفحص غرفة زيجموند

ويخضع اللحمة المتوسطة الجمجمة الحركات المثيرة التي توفر morphogenic المرجح قوة دافعة للارتفاع طيات...

مقايسة لتقييم سلوك يزدرع الخلوية من اللحمة المتوسطة القحف

يصف هذا البروتوكول كيفية تشريح premigratory قمة العصبية القحفية (NC) من القيطم neurulas المورق. هذه إإكسبلنتس يمكن مطلي على فبرونيكتين وتربيتها في المختبر، أو المطعمة مرة أخرى إلى الأجنة المضيفة. هذه التقنية تسمح بدراسة آليات NC ظهارة إلى اللحمة المتوسطة التي تمر بمرحلة انتقالية، والهجرة، والتمايز.

تشريح<em&gt; القيطم المورق</em&gt; العصبية كريست ل<em&gt; في المختبر</em&gt; يزدرع الثقافة أو<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; زرع

الخواص الميكانيكية والمجهرية من المصفوفة خارج الخلية تؤثر بقوة الهجرة 3D من الخلايا. طريقة في المختبر لدراسة السلوك الزماني المكاني هجرة الخلايا في بيئات متغيرة biophysically، في كل من السكان ومستويات الخلايا الفردية، يوصف.

نظام جل متحدة المركز لدراسة دور الفيزيائية الحيوية من مصفوفة المكروية في 3D خلية الهجرة

الظهارية إلى الانتقال اللحمة المتوسطة (EMT) تسمح للسرطانات بأن تصبح غازية. للتحقيق في EMT ، يتم وصف نموذج مختبري قائم على الخلايا الجذعية العصبية (NSC) خال من المصل والإنزيمات. يسمح هذا النظام الموحد بالتقييم الكمي والنوعي لهجرة الخلايا والتعبير الجيني والبروتيني. النموذج مناسب لاكتشاف الأدوية.

نموذج الانزيمات والمصل خالية من العصبية الثقافة الخلايا الجذعية لEMT التحقيق مناسبة للاكتشاف المخدرات

هنا، نحن نقدم طريقة منخفضة التكلفة وموثوق بها لتوليد اليكتروبوراتيد الدماغ أورجانوتيبيك شريحة الثقافات من أجنة الفأر مناسبة للفحص المجهري [كنفوكل] وتقنيات التصوير العيش.

الرحم السابقين انهانسر والثقافات أورجانوتيبيك شريحة من أدمغة الفأر الجنينية للعيش-التصوير لترحيل إينتيرنيورونس جابايرجيك

يصف هذا البروتوكول تشريح وثقافة خلايا الجمجمة العصبية القحفيه من نماذج الفئران ، وذلك في المقام الأول لدراسة هجره الخلايا. نحن وصف تقنيات التصوير الحية المستخدمة وتحليل التغيرات السرعة وشكل الخلية.

تشريح والثقافة وتحليل خلايا الجمجمة العصبية الابتدائية من الماوس لدراسة الخلية كريست العصبية الترقيم والهجرة

يصف هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات عزل خلايا القمة العصبية المهاجرة (NCCs) من خلال استئصال الطيات العصبية القحفية من أجنة الكتاكيت. عند الطلاء والحضانة ، تظهر NCCs المهاجرة من الطيات العصبية ، مما يسمح بتقييم مورفولوجيا الخلية والهجرة في بيئة 2D مبسطة.

إعداد وتحليل مورفولوجي لمزارع خلايا القمة العصبية القحفية للكتكوت

اكتشف تقييم هجرة خلايا القمة العصبية في مصفوفة غنية بالهيالورونان خارج الخلية. تتيح هذه الطريقة دراسة الالتصاق والهجرة الخلوية وتسريع اكتشاف الأدوية المؤثرة في تحلل حمض الهيالورونيك.

في المختبر التحقيق في آثار المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان على هجرة خلايا القمة العصبية

استكشف المزيد من الفيديوهات