توليد فعال ومتسق لظهارة صبغية شبكية العين / المشيمية من العين البشرية للتحليل النسيجي
October 28th, 2022
نحن نصف طريقة لفصل ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) بكفاءة عن شبكية العين في عيون الإنسان وتوليد حوامل مسطحة RPE / المشيمية كاملة للتحليلات النسيجية والمورفومترية ل RPE.
تساعد هذه الطريقة على فهم الاختلافات المظهرية لخلايا RP عبر شبكية العين البشرية بأكملها. تقنية التشريح التي طورها دافيد أورتولان قابلة للتكرار بشكل كبير في توليد انفصال بين RP وشبكية العين. وبرنامج REShAPE ملموس حقا في تحليل الصور الكبيرة لحوامل RP المسطحة.
يمكن استخدام الطريقة التي طورها دافيد لدراسة الاختلافات الإقليمية في النمط الظاهري RP من المرضى الذين يعانون من أنواع مختلفة من الأمراض التنكسية في شبكية العين. للبدء ، قم بقطع الأنبوب المخروطي 50 ملليلتر أقل بقليل من علامة 5 ملليلتر. باستخدام الغراء الساخن ، قم بتوصيل طرف الأنبوب بقاع قارب الوزن.
ثم امزج مكونين من مجموعة المطاط الصناعي السيليكوني بنسبة 10 إلى 1 لتجنب حبس الهواء. صب المزيج في وعاء الوزن الذي يحتوي على هذه القطعة الكروية من الأنبوب السفلي المستدير. علاج السيليكون في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
قم بإزالة قارب الوزن والأنبوب السفلي المستدير من قالب السيليكون المعالج. أولا ، املأ حقنة سعة 1 ملليلتر ب 1700 ملليمول من محلول D-Mannitol وأرفقها بإبرة قياس 21. أدخل الإبرة من خلال pars plana لتجنب ثقب الغرفة الأمامية للعين وحقن 400 ميكرولتر من المحلول في الجسم الزجاجي.
اترك العين في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. باستخدام زوج من المقصات الدقيقة والملقط ، قم بفتح الغرفة الأمامية على مستوى pars plana. املأ حجرة العين الخلفية ب DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.
تحت المجهر الاستريو ، قم بتوطين البقعة المرئية كبقعة صفراء على شبكية العين. قطع العين إلى أرباع ، وهي الأنف ، والزماني ، والأعلى ، والسفلي ، مع ضمان الحفاظ على المنطقة البقعية. قم بإزالة الإبر إذا كانت في الطريق.
انقل الفراشة إلى الغرفة الخلفية للعين إلى طبق بتري 100 ملم يحتوي على DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. قبل إزالة الشبكية ، ضع علامة على البتلة التي تحتوي على البقعة عن طريق إجراء قطع على شكل حرف V في الهامش الهدبي. رفع وقطع كل الجسم الزجاجي الذي يضع على شبكية العين.
قطع شبكية العين من الهوامش الهدبية في جميع بتلات لضمان عدم خدش RPE. ضع المنديل في 4٪ PFA واحتضنه لمدة ساعة واحدة. اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.
انقل الأنسجة إلى وعاء مملوء بنفس المخزن المؤقت وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، انقل العينة إلى طبق بتري 100 ملم يحتوي على DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. لكمة رأس العصب البصري بكمة خزعة 1.5 ملم.
جمع شبكية العين وتخزينها في نفس المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية. لإزالة الصلبة من المشيمية RPE ، ارفع برفق طبقة المشيمية RPE من المحيط. ثم باستخدام زوج من مقص Vannas Spring ، قم بقطع الأوعية المشيمية والنسيج الضام الموجود بين الصلبة و RPE.
بعد الانفصال التام عن الصلبة ، اجمع طبقة المشيمية RPE. انقل المنديل إلى وعاء مملوء ب DPBS يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ، وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية. انقل المشيمية RPE إلى بئر واحد من لوحة من ستة آبار.
قم بحظر العينة واختراقها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. احتضان العينة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع phalloidin مترافق مع 647 فلوروفور بتخفيف من 1 إلى 250 في مخزن النفاذية. يغسل ثلاث مرات في DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.
انقل عينة RPE المشيمية إلى شريحة زجاجية مقاس 50 × 75 ملم وقم بتسطيحها. قطع كل بتلة إلى قسمين لجعل العينة أكثر تسطحا. ارسم محيطا للحامل المسطح بقلم كاره للماء.
لإخماد التألق الذاتي للليبوفوسين ، أضف 500 ميكرولتر من محلول إخماد التألق الذاتي ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. تغسل جيدا في DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. قم بإزالة DPBS وأضف وسيط التركيب.
ضع غطاء زجاجي على الحامل المسطح وأغلقه بطلاء الأظافر. افتح البرنامج. في علامة التبويب الدلائل ، حدد مجلدات الإدخال والإخراج.
في دليل الإخراج ، دع البرنامج يغير المسار تلقائيا إلى دليل الإدخال أو العملية. بدلا من ذلك ، قم بتغيير دليل الإخراج يدويا. لإنشاء خرائط حرارية ، حدد الكل من القائمة المنسدلة في علامة التبويب إنشاء صور ملونة.
حدد المربع لا في ميزة استخدام الحدود اليدوية للسماح للبرنامج باستخدام الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم المكتشفة في كل صورة. حدد المربع نعم لضبط نطاق القيم يدويا لكل خريطة حرارية مترية للشكل. ثم انقر فوق الزر "تعيين الحدود" وأدخل القيم في مربعات النص لاختيار نطاقات للمعلمات الفردية.
بعد تغيير قيم الاهتمام ، انقر فوق حفظ. انقر فوق الإعدادات الافتراضية المنخفضة لإعادة تعيين جميع الحدود. لتحديد عتبة حجم الخلية في حجم الخلية الأقل، أدخل حجم أصغر خلية ليتم تضمينها في التحليل.
في حجم الخلية العلوي، أدخل حجم أكبر خلية ليتم تضمينها. في تحويل وحدات البكسل إلى وحدات حقيقية ، حدد لا لتشغيل التحليل بوحدات البكسل ، حدد نعم لتشغيل التحليل بالميكرومتر. في طول بيكسلات شريط المقياس، أدخل قيمة البيكسل في مربع النص.
في طول ميكرون شريط المقياس ، أدخل المسافة المقابلة بالميكرومتر. لبدء التحليل ، اضغط على go for it. ينتج عن هذا البروتوكول صورة أحادية المستوى لحامل مسطح حيث يتم تحديد موقع الخلية من خلال التجزئة التي تم إنشاؤها بواسطة REShAPE لحدود خلية RPE.
أيضا ، يتم قياس 30 مقياسا للشكل ، بما في ذلك مساحة الخلية لخلايا RPE الفردية ، لكل خلية RPE محددة بشكل صحيح. يمكن إزالة البلاط الأسود الناتج عن القطع المتبقية من شبكية العين أو الأجسام الساطعة الأخرى عن طريق اختيار أحد خيارات التصفية المتاحة في القائمة المنسدلة مرشح RT. سيؤدي استخدام صور RBG لتحليل إعادة التشكيل إلى إنتاج صور ثنائية سوداء بالكامل.
في حالة حدوث ذلك، سيؤدي تحويل صور RGB إلى مقياس رمادي إلى إنتاج صور ثنائية مجزأة بشكل صحيح. إذا لم يكن التلوين مثاليا أو إذا تضررت العينة بسبب خدش ، فيمكن تحديد كتل كبيرة من الخلايا كخلية واحدة كبيرة جدا. في هذه الحالة ، يمكن استبعاد الكائنات الكبيرة من التحليل عن طريق تغيير عتبة حجم الخلية.
للحصول على نسيج مسطح ، يجب فصل RP والمشيمية عن الصلبة حتى لو كانت هذه الخطوات قد تستغرق وقتا طويلا. بعد إنشاء حامل RP المسطح ، من الممكن تلطيخ علامات RPE إضافية بحيث يمكنك دراسة مناطق مختلفة من الطبقة الأحادية RP. باستخدام هذه الطريقة ، اكتشفنا خمس مجموعات مختلفة من RP حساسة بشكل تفاضلي للأمراض التنكسية المختلفة في شبكية العين.
المحة عامة
تقدم الدراسة طريقة جديدة لفصل الظهارة الصباغية الشبكية (RPE) عن الشبكية البشرية بشكل فعّال، مما يُمكّن من إنتاج تركيبات مسطحة كاملة من RPE/القزحية. هذا النهج يسهّل التحليل النسيجي والمورفومتري، مما يعزز فهم الاختلافات المظهرية في خلايا RPE عبر الشبكية البشرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- بحوث الشبكية
- التحليل النسيجي
- دراسات المورفومتري
الخلفية
- الأمراض التنكسية للشبكية تظهر خصائص مظهرية متنوعة.
- فهم الاختلافات في خلايا RPE أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات علاجية.
- التكرار العالي لتقنية التشريح أمر حيوي للحصول على نتائج متسقة.
الطرق المستخدمة
- تقنية تشريح طورت لفصل RPE عن الشبكية
- الشبكية البشرية كنظام بيولوجي
- استخدام برنامج REShAPE لتحليل التركيبات المسطحة لـRPE
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق فصل ناجح لـRPE عن الشبكية بطريقة قابلة للتكرار.
- سمح التحليل المحسن من خلال البرنامج بتقييمات مورفومترية مفصلة.
- سهّل التحقيق في الاختلافات الإقليمية في ظاهرة RPE المرتبطة بأمراض شبكية مختلفة.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة طريقة موثوقة لاستخراج RPE، وهي أداة مهمة للتحقيق في صحة الشبكية.
- تقدم النتائج في فهم آليات الأمراض الشبكية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Consistent generation of RPE/choroid flatmounts from human eyes enables high-fidelity phenotypic analysis critical for early discovery and target validation in retinal disease research. The integration of reproducible tissue separation with quantitative morphometric analysis supports predictive confidence in disease modeling and biomarker identification. This workflow strengthens translational continuity from discovery through preclinical evaluation for retinal therapeutics portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of regional RPE phenotypes relevant to disease mechanisms.
- Supports functional target validation by preserving RPE cell morphology and junctions.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative shape metrics across the epithelium.
- Improves predictive confidence for prioritizing retinal disease targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible flatmounts for downstream cellular assays.
- Delivers quantitative outputs via AI-based segmentation and morphometric analysis.
- Enables scalable preparation of samples for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on RPE morphology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling analysis of RPE populations sensitive to degeneration.
- Maintains continuity from human tissue discovery to preclinical model validation.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on robust phenotypic data.
- Supports translational biomarker identification through region-specific analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from hypothesis testing to lead identification in retinal disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling region-specific RPE analysis.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible flatmounts with quantitative morphometric outputs.
- Analytics: Provides 30 shape metrics per cell for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects human tissue findings to preclinical model validation for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable workflow adaptable to other species and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in retinal target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tissue preparation and analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of retinal disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human ocular tissue dissection and handling.
- Needs access to fluorescence imaging and AI-based morphometric analysis software.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and analysis.
- Adaptable to other animal models with protocol optimization.
- Sample integrity and staining quality are critical for accurate segmentation and quantification.
