تقنيات وممارسات زراعة الخلايا لتجنب التلوث بالفطريات والبكتيريا في مختبر زراعة الخلايا البحثية

زراعة الخلايا هي مهارة دقيقة ضرورية لزراعة أنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة في بيئة معملية خاضعة للرقابة. الشاغل الرئيسي عند القيام بعمل زراعة الخلايا هو التلوث. يمكن أن يأتي هذا التلوث في شكل بكتيريا أو عفن أو ميكوبلازما.

ستضمن جميع التقنيات والممارسات الموضحة في هذا الفيديو بقاء خلاياك قابلة للحياة وصحية وخالية من التلوث. يجب الالتزام الصارم بهذه الممارسات ، ويجب أن يتلقى جميع موظفي المختبر التدريب مرة واحدة على الأقل في السنة. قبل البدء في العمل ، ارتد معطفا مختبريا نظيفا مخصصا للاستخدام في غرفة زراعة الخلايا فقط.

ارتد قفازات جديدة لم تلمس أي أسطح أخرى. تأكد من أن القفازات مناسبة بإحكام. قفازات خالية من مسحوق النتريل هي الأفضل.

لا يلزم أن يكون معطف المختبر والقفازات معقمة. للتحضير للعمل ، رش القفازات وأكمام معطف المختبر والجزء الداخلي من خزانة السلامة البيولوجية بنسبة 70٪ من الإيثانول. رش سطح العمل والجوانب والظهر وأي عناصر في الخزانة واللوحة الزجاجية الأمامية ، من الداخل والخارج.

امسح سطح العمل واللوحة الزجاجية جافة بمنشفة ورقية خالية من النسالة. خذ بعض الوقت لترتيب مساحة العمل داخل الخزانة. احتفظ بحمامات مائية داخل غرفة زراعة الخلايا واستخدمها فقط لأغراض زراعة الخلايا ، مثل تسخين الوسائط أو إذابة الخلايا.

يجب تصريف الحمامات المائية وغسلها مرة واحدة في الأسبوع. قلل من كمية العناصر التي يتم إحضارها إلى الخزانة ولا تقاطع تدفق الهواء داخل خزانة الأمان البيولوجي عن طريق سد الشوايات الأمامية أو الخلفية. رش جميع العناصر الموضوعة داخل الخزانة بنسبة 70٪ إيثانول وامسحها حتى تجف.

ابدأ برش الجزء العلوي من زجاجة الوسائط وشق طريقك لأسفل. باستخدام منشفة ورقية نظيفة ، ابدأ من أعلى زجاجة الوسائط لمسحها حتى تجف ، وشق طريقك تدريجيا إلى الأسفل. لا تعود نحو الغطاء.

الطريقة التي تعمل بها هذه الخزانات هي أنها تسحب الهواء من الغرفة والخزانة نفسها من خلال الشوايات الأمامية والخلفية. يذهب الهواء نحو الجزء الخلفي من الخزانة وحتى الأعلى. هناك ، يمر الهواء الملوث عبر كومة من المرشحات ، ويتم دفع جزء من الهواء النظيف المصفى لأسفل على منطقة العمل في الخزانة.

إذا كانت الخزانة كبيرة بما يكفي لاستيعاب الماصات المصلية ، فيمكن وضعها في الداخل ، وإلا يمكن تخزينها في وعاء مثبت على السطح الخارجي للخزانة. من الممارسات الجيدة فحص جانبي الماصة المغلفة بحثا عن ثقوب أو تمزقات أو ثقوب في العبوة قبل الاستخدام. لا تمزق الغلاف.

بدلا من ذلك ، قشر أطراف الغلاف برفق. أدخل الماصة المصلية في أداة مساعدة الماصة وقم بإزالة الغلاف بحركة سائلة واحدة. لا تحوم فوق أي زجاجات أو قوارير مفتوحة.

لا ينصح بالوصول إلى زجاجة أو قارورة مفتوحة ، أو العمل فوق قوارير مفتوحة. تدفق الهواء داخل الخزانات يدفع لأسفل على أي شيء بالداخل. سيسمح الوصول إلى أكثر من ذلك بأن يكون كمك أو قفازك فوق العناصر التي يمكن أن تدفع أي تلوث موجود على جعبتك على سبيل المثال ، إلى مزرعة خليتك.

كلما كان ذلك ممكنا ، لا تصب السوائل. بدلا من ذلك ، قم بإضافتها باستخدام ماصة مصلية. امزج المحتويات جيدا وقم ببدء الزجاجة.

اكتب ما تستكمل به الوسائط. إذا كنت تعمل مع ثقافات ملتصقة وتحتاج إلى قارورة بلاستيكية ، فقم برش العبوة بأكملها ووضعها في الداخل. في أي وقت تجف فيه قفازاتك ، قم برشها بالإيثانول مرة أخرى.

عند العمل مع خط خلية ملتصق ، استخدم ماصات زجاجية معقمة أو ماصات بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها لشفط الوسائط أو محاليل الغسيل. قم بإزالة الغطاء المعدني بعناية من حاوية التخزين. اعزل ماصة زجاجية واحدة عن طريق هز الحاوية برفق بزاوية.

عند الوصول إلى الحاوية ، تجنب لمس أي ماصات أخرى. تعامل مع الماصة المختارة من طرف واحد فقط. استبدل الأغطية الموجودة على الزجاجات والقوارير بسرعة في أسرع وقت ممكن.

ضع أغطية على سطح العمل رأسا على عقب حتى لا تلمس الحافة سطح العمل. لا تمسك الغطاء من الأعلى أو الأسفل. بدلا من ذلك ، المس قبعات من الجانبين.

عند شفط السوائل ، استخدم قارورة مصيدة فراغ تقع خارج الخزانة في حاوية ثانوية على الأرض. سيتم إنشاء النفايات أثناء العمل داخل الخزانة. نظرا لأن تحريك اليدين داخل وخارج الخزانة كثيرا سيقطع تدفق الهواء ، فلا بأس من ترك أي نفايات داخل الخزانة مؤقتا.

ضعه جانبا حتى لا يقاطع عملك. رش القفازات بسخاء بنسبة 70٪ من الإيثانول في أي وقت تصبح جافة. افرك يديك معا حتى لا تقطر مبللة.

ملاحظة سريعة حول الماصات المصلية. إذا لمسوا عن طريق الخطأ شيئا آخر في غطاء المحرك ، فلا تتردد في التخلص منهم. من الأفضل أن تبدأ من جديد باستخدام ماصة مصلية نظيفة بدلا من استخدام ماصة قد تكون ملوثة.

قبل وضع الخلايا في الحاضنة ، تحقق لترى كيف تبدو تحت المجهر. يجب مراعاة الخلايا المفردة. يشير هذا إلى إعادة تعليق الخلايا تماما.

لا تتحدث أو تعطس أو تسعل أو تتنفس بشدة في الحاضنات. فتح وإغلاق أبواب الحاضنة بسرعة. قد يسمح تركها مفتوحة لفترة أطول من اللازم للملوثات الموجودة في الهواء بدخول الحاضنات.

تأكد من إغلاق أغطية جميع الزجاجات تماما قبل إخراجها من الخزانة. الوسائط حساسة للضوء. يجب تخزينه في الظلام عند أربع درجات مئوية عندما لا يكون قيد الاستخدام.

رش الجزء الداخلي من الخزانة بنسبة 70٪ إيثانول مرة أخرى بعد اكتمال أعمال زراعة الخلايا وامسح السطح حتى يجف بمنشفة ورقية. أفرغ كيس النفايات البيولوجية الخطرة. كرر هذه العملية واستبدل القفازات عند التبديل إلى خط خلية مختلف.

عند العمل مع ثقافات التعليق المزروعة في قوارير زجاجية ، تأكد من أن القفازات مبللة. المس رقائق الألومنيوم بقفازاتك المبللة ثم رش الجزء السفلي من القارورة فقط قبل وضعها داخل خزانة السلامة البيولوجية. عند أخذ عينة لعد الخلايا ، قم بإزالة أنبوب واحد فقط سعة 1.5 مل من الحاوية الخاصة به.

لا تلمس أيا من الأنابيب الأخرى. ضع الغطاء رأسا على عقب على سطح العمل. لا تلمس الحافة الداخلية.

تعامل معها بعناية من الجوانب واستبدلها بمجرد الانتهاء. عند التعامل مع خلايا التعليق والقوارير الزجاجية ، قم بإزالة قطعة رقائق الألومنيوم المطوية المزدوجة بعناية والتي تغطي عنق القارورة بالكامل. اسحب برفق جميع الزوايا الأربع وضع الرقاقة رأسا على عقب على سطح العمل.

تعامل مع القارورة الزجاجية من الأسفل فقط. لا تلمسه من الرقبة بمجرد إزالة الرقاقة. استخدم ماصة مصلية سعة 1 مل لأخذ عينة لعد الخلايا.

لا تدع الوسائط تقطر على جانب القوارير. إذا حدث ذلك ، قم برش منشفة ورقية بنسبة 70٪ إيثانول وقم بتنظيفه على الفور. تأكد من إحكام ربط الأغطية أو رقائق الألومنيوم قبل إزالة الزجاجات أو القوارير من خزانات السلامة البيولوجية.

استخدم حاضنات منفصلة لأنواع الخلايا المختلفة. هذا سيمنع التلوث المتبادل لأنواع الخلايا المختلفة. يوصى بوضع قارورة مصيدة التفريغ لجمع النفايات السائلة خارج الخزانة على الأرض في حاوية ثانوية تحمل علامة النفايات.

يتم توصيل الخرطوم بفلتر يتم استبداله على أساس شهري. يدخل الخرطوم عبر جانب الخزانة. قم بإزالة القمامة البيولوجية بمجرد اكتمال العمل.

احتفظ ببروتوكول غسيل الزجاج على الحائط بجوار الحوض. أولا ، انقع الخلايا المهملة بنسبة 10٪ مبيض لمدة خمس دقائق تقريبا. ثم تخلص من خليط التبييض واشطف القارورة جيدا بالماء.

أضف الصابون بالماء ، وافركه بفرشاة جيدا ، واشطفه بمزيد من الماء. ثم الخطوة الأخيرة هي شطف الأواني الزجاجية بماء DI على الصنبور على اليمين. اغسل القوارير الزجاجية في أسرع وقت ممكن ، افرك الأواني الزجاجية جيدا.

ستترك خلايا Sf9 حافة الخلايا الميتة هذه إذا لم يتم تنظيفها بشكل صحيح. استخدم هذه القوارير فقط لزراعة الخلايا ، والأواني الزجاجية لزراعة خلايا الأوتوكلاف بدلا من إرسالها إلى منشأة غسيل الزجاج. استخدم دورة الفراغ على الأوتوكلاف لمدة 40 دقيقة من وقت التعقيم و 40 دقيقة من وقت الجفاف.

احتفظ بها منفصلة عن الأواني الزجاجية في المنطقة الرئيسية من المختبر. تنظيم غرفة زراعة الخلايا بحيث تكون جميع الإمدادات موجودة في منطقة واحدة ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى خروج أعضاء المختبر من غرفة زراعة الخلايا بحثا عن الإمدادات. قم بتسمية أي زجاجات بلاستيكية تستخدم لحصاد الخلايا وإعادة استخدامها في زراعة الخلايا بعد ذلك ، لاستخدام زراعة الخلايا فقط.

استخدم زجاجات زراعة الخلايا المخصصة لنوع خلية واحد محدد. قم بتخزين هذه الزجاجات في غرفة زراعة الخلايا لسهولة الوصول إليها. بالنسبة للثقافات التي تزرع في التعليق ، سيتم التعرف على العفن على أنه كرات عائمة في الوسائط.

أما بالنسبة للتلوث البكتيري ، فسوف يحول الوسائط إلى اللون الأبيض والغائم. وبالمثل ، بالنسبة للخلايا الملتصقة ، يمكن التعرف بسهولة على تلوث العفن على أنه بقع غامضة. سوف يتحول التلوث البكتيري عادة إلى وسائط صافية ، بيضاء وغائمة.

يمكن تحديد العديد من أنواع الميكوبلازما بشكل موثوق باستخدام مقايسة PCR. يوضح الشريط الموجود على اليسار معايير الوزن الجزيئي للحمض النووي. النطاقات الأربعة الموجودة على اليمين هي عناصر تحكم موجبة.

لا تظهر أي نطاقات تحت أنواع الخلايا المختبرة لأنه لم يتم اكتشاف الميكوبلازما. سيتغير لون وسائط زراعة الخلايا من الأحمر إلى الأصفر في حالة وجود مؤشرات الأس الهيدروجيني. يشير اللون الأصفر إلى أن الرقم الهيدروجيني منخفض ويجب استبدال الوسائط.

إذا لوحظت زيادات أو أشكال خلايا أخرى تحت المجهر الضوئي أثناء إجراء تعداد الخلايا ، فقد يكون هذا مؤشرا على التلوث. لاحظ أنه يجب إجراء تطهير شامل لمقياس الدم قبل عد الخلايا لأن هذا النوع من الحطام قد يكون موجودا فقط على مقياس الدم وليس في مزرعة الخلية نفسها. في حين أن التلوث هو أحد الاهتمامات الرئيسية عند إجراء عمل زراعة الخلايا ، يمكن التخفيف من هذه المخاطر باتباع الممارسات والتقنيات الموضحة في هذا الفيديو.

إذا تم إجراء اختبار الميكوبلازما الشهري كل شهر ، يتم تدريب موظفي المختبر على أساس سنوي ويتم الالتزام الصارم بهذه الممارسات ، ثم ستبقى خلاياك صحية وخالية من التلوث. سيساعد هذا أيضا في تقليل التكاليف المرتبطة بشراء وسائط زراعة الخلايا باهظة الثمن ، وشراء خلايا جديدة ، وسيقلل من وقت تعطل إزالة التلوث من الحاضنة. تذكر أن مفتاح نجاح زراعة الخلايا هو العمل المبكر لمنع التلوث في المقام الأول.