الكشف عن الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) وقياسه في البلازما البشرية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم المعدل

يسمح بروتوكول ELISA المعدل هذا بتنقية وقياس دقيق ل CGRP في البلازما البشرية. وقد خضع لتجارب التحقق اللازمة ويمكن أن يعمل على توحيد منهجيات القياس الكمي في المستقبل. يوفر هذا البروتوكول مزايا تضمين معالجة العينات قبل تدهور البروتياز بشكل كبير ، والتنقية عن طريق استخراج الطور الصلب ، والحد من الارتباط غير المحدد عن طريق تطبيق المخزن المؤقت المانع على ألواح المعايرة الدقيقة.

يلعب CGRP دورا عقابيا في الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي وربما مرشحا لحالة العلامات الحيوية. كما أنها متورطة في عمليات أمراض القلب والأمراض الجلدية والفيروسية وحتى المتعلقة ب COVID-19. للبدء ، اجمع 5 ملليلتر من الدم الكامل من الوريد قبل التكعيبي من خلال طرق بزل الوريد القياسية في أنبوب EDTA فراغ 6 ملليلتر.

لمنع تحلل الببتيد المستهدف ، أضف 0.5 ملليلتر من مثبط الأنزيم البروتيني التنافسي للبروتين الأبروتينين. اقلب الأنبوب 10 مرات وقم بتخزينه على الثلج حتى الخطوة التالية. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 600 4g لمدة أربع دقائق عند 4 درجات مئوية.

ونقل جزء البلازما إلى قارورة تبريد معقمة مستديرة القاع 2 ملليلتر. قم بتخزين قارورة التبريد على الفور عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوعين. لاستخراج عينة البلازما ، ضع خرطوشة استخراج داخل أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 ملليلتر.

مرر 5 ملليلتر من الميثانول بنسبة 100٪ ، ثم 10 ملليلتر من الماء عالي النقاء من خلال الخرطوشة لتنشيطها. سيتم جمع السائل في الأنبوب أثناء مروره عبر الخرطوشة عن طريق التدفق المدفوع بالجاذبية. تخلص من السوائل الزائدة المتراكمة لمنعها من ابتلاع الخرطوشة وتأكد من عدم جفافها أثناء التجربة.

تمييع 250 ميكرولتر من البلازما في 750 ميكرولتر من حمض الخليك 4 ٪ ، وتمريرها ببطء من خلال الخرطوشة. ثم اغسل الخرطوشة ب 10 ملليلتر من حمض الخليك. بمجرد إزالة السائل الزائد ، انقل الخرطوشة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 15 ملليلتر.

تحضير 3 ملليلتر من محلول حمض الخليك الميثانول للتخلص من الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين أو CGRP. مرر 1 ملليلتر منه عبر الخرطوشة وانتظر لمدة 25 دقيقة بين كل شطف. بعد الشطف الأخير ، يحتوي الأنبوب على 3 ملليلتر من إجمالي الشحوم.

نقل 1 ملليلتر من eluant إلى أنبوب طرد مركزي صغير 1.7 ملليلتر ، وتدويره في جهاز طرد مركزي صغير لمدة ثانية واحدة لتسوية eluant. ثم جفف العينة في جهاز طرد مركزي فراغي عند 1،400 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية. مباشرة قبل الفحص ، أعد تكوين العينة المجففة باستخدام المقايسة المناعية للإنزيم المذاب أو المخزن المؤقت لتقييم الأثر البيئي.

لحجب الألواح ، أضف 250 ميكرولترا من المخزن المؤقت لحجب جيلاتين الأسماك TBS إلى كل بئر. ضع ورقة غطاء فوق اللوحة واحتضانها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة ورقة الغلاف وأفرغ اللوحة عن طريق قلبها.

ثم امسح اللوحة على منشفة ورقية للتخلص من أي سائل أثر وجففه في غطاء تدفق رقائقي لمدة 10 دقائق. بمجرد أن يجف الطبق بشكل واضح ، ضعه في كيس رقائق محكم الغلق بقبضة مع كيس مجفف من هلام السيليكا. قم بتخزينه في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة.

قبل إجراء الفحص ، قم بإذابة جميع العينات والكواشف المعدة في درجة حرارة الغرفة. لشطف آبار لوحة الكتلة ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل واتركه لمدة 30 ثانية. ثم تخلص من المخزن المؤقت للغسيل وكرر الشطف خمس مرات.

بعد الشطف الأخير ، لطخة اللوحة كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتقييم الأثر البيئي إلى بئرين مخصصين غير محددين أو NSB. أضف 100 ميكرولتر من معايير CGRP ، متبوعة بالعينة المعاد تشكيلها ومراقبة الجودة في نسختين في الآبار المناسبة.

أضف 100 ميكرولتر من جهاز تتبع CGRP إلى كل بئر ، باستثناء الآبار الفارغة. أخيرا ، أغلق اللوحة باستخدام ورقة غطاء شفافة ، مع التأكد من عدم تبخر العينات والكواشف ، واحتضان اللوحة لمدة 16 إلى 20 ساعة عند 4 درجات مئوية. عندما تنتهي فترة الحضانة ، قم بإعداد كاشف Ellman وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

بمجرد صب الطبق ، اغسل كل بئر ثلاث مرات كما هو موضح سابقا. بعد الشطف الأخير ، هز اللوحة عند 120 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. مرة أخرى ، شطف لوحة ثلاث مرات وصمة عار حتى يجف.

اضغط على اللوحة المقلوبة حتى تتم إزالة السائل بشكل واضح من الآبار. ثم أضف 200 ميكرولتر من كاشف إيلمان في كل بئر باستثناء الآبار الفارغة. بمجرد تغطية اللوحة ، لفها بورق الألمنيوم لمنع أي تعرض للضوء واحتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة قبل تسجيل الامتصاص.

أظهرت الدراسة الحالية أنه بإضافة خطوة الحظر ، كانت معدلات الاسترداد في كل عينة ارتفاع CGRP ضمن النطاق المقبول. ومع ذلك ، عندما تم استبعاد خطوة الحظر ، أدى الارتباط غير المحدد إلى معدلات استرداد تتجاوز الحد الأعلى البالغ 125٪من المهم إضافة الأبروتينين للاحتفاظ بعينات الدم بعد وقت قصير من جمعها للحد من تدهور CGRP. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إضافة المخزن المؤقت للحظر إلى لوحة العيار الدقيق قبل ELISA لتقليل الارتباط غير المحدد بشكل أكبر.

لذلك يمكن استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف ترشيح CGRP كمؤشر حيوي للصداع النصفي الدهليزي عن طريق تحديد مستويات CGRP في مرضى البلازما المصابين بالصداع النصفي والصداع النصفي الدهليزي مقابل الضوابط.