Name: القياس الكمي في الوقت الحقيقي لتأثيرات TnpB المرتبط بعائلة IS200 / IS605 على نشاط Transposon (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: اكتشف كيفية قياس تأثير بروتين TnpB على نشاط النقل الجيني في خلايا Escherichia coli الحية باستخدام التصوير الفلوري في الوقت الفقيق. يُظهر البروتوكول زيادة النشاط أربع إلى خمس مرات في الخلايا الموجبة لـ TnpB.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم توفير الدعم المالي لهذا البحث من خلال صناديق بدء التشغيل من جامعة كاليفورنيا.

1. إعداد الثقافات البكتيرية
<ol><li>تنمو سلالة الإشريكية القولونية MG1655 مع تركيبات ترانسبوزون البلازميد (الموصوفة سابقا في Kim et al.8) طوال الليل في LB مع المضادات الحيوية المناسبة (25 ميكروغرام / مل من الكانامايسين ، انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: تتوفر تسلسلات التركيبات المستخدمة والتسلسلات ذات الصلة كأرقام انضمام GenBank20 OP581959 و OP581957 و OP581958 و OP717084 و OP717085.</li>
	<li>لتحقيق نمو أسي ثابت ، قم بتخفيف الثقافات ≥100 مرة في وسط M63 (100 mM KH 2 PO 4 ، 1 mM MgSO 4 ، 1.8 μM FeSO 4 ، 15 mM [NH 4]2SO 4 ، 0.5 ميكروغرام / مل من الثيامين [فيتامين B1]) مكمل بمصدر كربون (0.5٪ وزن / فولت جلوكوز هنا) والمضادات الحيوية المناسبة (انظر جدول المواد).</li>
	<li>تنمو الثقافات عند 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) إلى ~ 0.2. الثقافات جاهزة للاستخدام.</li>
</ol>2. إعداد الشريحة
<ol><li>قم بإعداد شريحة عن طريق غلي M63 مع 0.5٪ وزن / فولت جلوكوز و 1.5٪ وزن / فولت أغاروز في الميكروويف لإذابة الأغاروز والتأكد من أنه منصهر تماما ومختلط جيدا.</li>
	<li>اترك الخليط يبرد إلى ~ 55 درجة مئوية قبل إضافة المضادات الحيوية والمحرضات (25 ميكروغرام / مل كاناميسين و 10 نانوغرام / ميكرولتر أنهيدروتيتراسيكلين [aTc] ، انظر جدول المواد).</li>
	<li>ضع شريحة مجهر على طاولة العمل. قم بتكديس شريحتين أخريين بشكل عمودي على الأولى وضع شريحة أخرى في الأعلى ، بالتوازي مع الشريحة السفلية. تأكد من وجود فجوة تساوي سمك شريحة واحدة بين الشرائح السفلية والعلوية. ماصة ~ 1 مل من خليط الأغاروز M63 في هذه الفجوة بين الشرائح ببطء لإنشاء مربع هلام صغير.</li>
	<li>بمجرد أن يتجمد الجل (~ 10-15 دقيقة) ، حرك الشريحة العلوية لإزالتها. تقليم وسادة agarose بشفرة حلاقة أو سكين. ثم ماصة 2.5 ميكرولتر من الثقافة (الخطوة 1.3) ووضع غطاء الغطاء في الأعلى.</li>
	<li>أغلق المسافة بين الشريحة وغطاء الغطاء باستخدام الإيبوكسي (انظر جدول المواد). اترك الإيبوكسي يجف وتستقر الخلايا على وسادة الأغاروز لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية.</li>
</ol>3. الفحص المجهري مضان الفاصل الزمني
<ol><li>ضع العينة المحضرة (الخطوة 1.3) على مجهر مضان (انظر جدول المواد) في بيئة يتم تسخينها وصيانتها عند 37 درجة مئوية.<ol><li>اضبط أوقات التعريض الضوئي المناسبة للكاميرا المستخدمة للحصول على الصورة. اضبط شدة الإضاءة لتقليل التبييض الضوئي. ملاحظة: تم استخدام وقت التعرض 2 ثانية لكل طول موجي للدراسة الحالية.</li>
		<li>لكل طول موجي ، ابحث عن مجال رؤية (FOV) يحتوي على الحد الأدنى من التألق. الحصول على صور لاستخدامها أثناء التحليل لطرح الخلفية.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بإعداد بروتوكول للحصول على الصور في شبكة بأطوال موجية مختلفة وعلى فترات زمنية منتظمة.<ol><li>ترميز التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني في البروتوكول. اضبط تردد الاكتساب على الفاصل الزمني المطلوب (20 دقيقة هنا) وإجمالي مدة الفاصل الزمني على الطول المطلوب (24 ساعة).</li>
		<li>ترميز الأطوال الموجية المناسبة في البروتوكول (اعتمادا على البناء المستخدم). ملاحظة: ذروة إثارة mCherry عند 587 نانومتر وذروة الانبعاث عند 610 نانومتر21 ؛ mVenus عند 515 نانومتر و 527 نانومتر12 ، بينما mCerulean3 عند 433 نانومتر و 475 نانومتر11.</li>
		<li>اضبط حجم الشبكة للالتقاط بين العدد المطلوب من FOVs. ملاحظة: استخدمت البيانات التمثيلية الموضحة هنا 8 × 8 FOVs.</li>
	</ol></li>
</ol>4. تحليل الصور
<ol><li>قم بإجراء طرح الخلفية على كل قناة ملونة باستخدام صور الخلفية ذات الصلة التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.2. بالنسبة لجميع خطوات التحليل ، نستخدم وحدات قياسية في النظام الأساسي مفتوح المصدر فيجي22 (انظر جدول المواد).</li>
	<li>قرب إجمالي السكان في كل نقطة زمنية عن طريق تحديد عتبة قناة mCerulean وقسمة منطقة العتبة على متوسط مساحة الخلية.</li>
	<li>لحساب أحداث الاستئصال الفريدة ، خذ الوقت المشتق من قناة mCerulean3. قم بذلك عن طريق طرح الصور المتتالية في قناة mCerulean3. سيتم الكشف عن أحداث الاستئصال في مشتق الوقت كميض ساطع من التألق.<ol><li>عتبة كومة أحداث الاستئصال للقضاء على مضان غير مرغوب فيه. لاحظ أن هذه العملية ستؤدي إلى استبعاد أجزاء من عمليات الاستئصال نفسها. لإصلاح ذلك ، قم بتوسيع الصور لاستعادة عمليات الاستئصال إلى أحجامها الأصلية. ملاحظة: يمكن إجراء تحليلات باستخدام تقنيات مماثلة للعتبة وتحليل الصور على قنوات التألق الأخرى أيضا (على سبيل المثال ، ربط أحداث الاستئصال بمستويات ترانسبوزاز TnpA [مضان الزهرة الأصفر] و TnpB [مضان الكرز الأحمر].</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li>
<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+in+tumors+and+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11(2014).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li>
<li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR%2FO%2C+the+TetR%2FO+and+AraC%2FI1-I2+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li>
<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
<li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896(2011).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li>
<li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori%3A+nonrandom+geographic+distribution%2C+functional+organization%2C+and+insertion+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).</li>
<li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+insertion+sequences%3A+their+genomic+impact+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li>
<li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+IS200%2FIS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li>
<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
<li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS200%2FIS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

الطريقة الفريدة المقدمة هنا للتصوير في الوقت الفعلي لنشاط العناصر القابلة للنقل في الخلايا الحية هي اختبار حساس يمكنه اكتشاف التحويل مباشرة في الخلايا الحية وفي الوقت الفعلي وربط هذا النشاط بالتعبير عن البروتينات الملحقة. في حين أن الإنتاجية أقل مما يمكن تحقيقه بالطرق السائبة ، فإن هذه الطريقة تحقق قياسات مفصلة لنشاط TE وتعبير البروتين في الخلايا الحية الفردية.
يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الأدوات والتقنيات لتنمية الخلايا مباشرة على المجهر للتصوير في الوقت الفعلي. تتميز الطريقة المستخدمة هنا ...

العناصر القابلة للنقل (TEs) هي عناصر وراثية تحشد داخل جينومها المضيف عن طريق الاستئصال أو تحفيز النسخ متبوعا بإعادة الاندماج الجينومي. توجد TEs في جميع مجالات الحياة ، ويعيد التحويل هيكلة الجينوم المضيف ، ويحور مناطق الترميز والتحكم1. هذا يولد الطفرات والتنوع التي تلعب دورا مهما في التطور2،3 ، والتنمية4،5 ، والعديد من الأمراض البشرية6 ، بما في ذلك السرطان7.
باستخدام التركيبات الجينية الجديدة التي تربط جوانب نشاط النقل بمراسلي الفلورسنت ، وصف عملنا السابق تطوير نظام تجريبي يعتمد على TE IS608 البكتيري ، وهو ممثل لعائلة IS200 / IS605 واسعة الانتشار من TEs ، والتي تسمح بالتصور في الوقت الفعلي للتبديل في الخلايا الحية الفردية8 (الشكل 1). يتم عرض نظام TE في الشكل 1A. يتكون TE من تسلسل ترميز transposase ، tnpA ، محاطا بالطرف الأيسر (LE) والطرف الأيمن (RE) التكرارات غير الكاملة (IPs) ، وهي مواقع التعرف والاستئصال ل TnpA. يتم التعبير عن tnpA باستخدام المروج PLTetO1 ، والذي يتم قمعه بواسطة مثبط tet ويمكن تحريضه باستخدام anhydrotetracycline (aTc)9. يقسم TE تسلسل -10 و -35 لمروج PlacIQ1 التأسيسي 10 للمراسل الأزرق mCerulean311. كما هو موضح في الشكل 1C ، عندما يتم تحفيز إنتاج tnpA ، يمكن استئصال TE ، مما يؤدي إلى إعادة تكوين المروج. تعبر الخلية المنتجة عن mCerulean3 وتتألق باللون الأزرق. يتم دمج المحطة N من TnpA مع المراسل الأصفر فينوس12 ، مما يسمح بقياس مستويات TnpA عن طريق التألق الأصفر.
IS608 وأعضاء آخرين من عائلة IS200 / IS605 من الترانسبوزونات عادة ما يشفرون أيضا جينا ثانيا للوظيفة غير المعروفة حتى الآن ، tnpB13. بروتينات TnpB هي عائلة وفيرة للغاية ولكنها غير كاملة من النيوكليازات المشفرة بواسطة العديد من TEsالبكتيرية والقديمة 14,15 ، والتي غالبا ما تتكون من tnpB16 فقط. علاوة على ذلك ، جددت الدراسات الحديثة الاهتمام ب TnpB من خلال العثور على أن TnpB يعمل كنوكلياز داخلي قابل للبرمجة موجه بالحمض النووي الريبي يشبه كريسبر / كاس والذي سيؤدي إما إلى فواصل dsDNA أو ssDNA في ظل ظروف متنوعة17,18. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح ما هو الدور الذي قد يلعبه TnpB في تنظيم النقل. لإجراء تصور في الوقت الفعلي لتأثيرات TnpB على تبديل IS608 ، تم إنشاء نسخة من transposon ، بما في ذلك منطقة الترميز من TnpB مع اندماج N-terminal إلى بروتين الفلورسنت الأحمر mCherry.
استكمالا للدراسات الأكثر تفصيلا على مستوى الجزء الأكبر التي أجراها مختبر كولمان19 ، يظهر هنا كيف يمكن للتصوير في الوقت الفعلي لنشاط الترانسبوزون أن يكشف كميا عن تأثير TnpB أو أي بروتينات ملحقة أخرى على ديناميكيات النقل. من خلال دمج TnpB إلى mCherry ، يتم تحديد أحداث النقل الفردية بواسطة التألق الأزرق وترتبط بمستويات التعبير عن TnpA (التألق الأصفر) و TnpB (التألق الأحمر).

<table><tbody><tr><td>2 طن واضح الايبوكسي</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الأمونيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline هيدروكلوريد</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>ليزر الأرجون</td><td>Melles Griot</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>مكعب مرشح أزرق</td><td>كروما</td><td>على سبيل المثال: Z457 / 10X ، Em: ET485 / 30M</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>توقف</td></tr><tr><td>صناديق Eppendorf epTIPS وصواني إعادة التعبئة ، الحجم: 0.1 إلى 10 & micro ؛ L ، الطول: 3.4 سم ، 1.33 بوصة ، PP (بولي بروبيلين)</td> <td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Boxes وصواني إعادة التعبئة ، الحجم: 50 إلى 1000 ميكرو ؛ L ، الطول: 7.1 سم ، 2.79 بوصة ، PP (بولي بروبلين)</td> <td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الحديدوز Acs 500 جم</td><td>فيشر Scientific</td><td>706834</td><td></td></tr><tr><td>فيجي</td><td></td><td></td><td>فيجي (imagej.net)</td></tr> <tr><td>Fisher BioRecodes&nbsp;LB Broth ، Miller (Granulated)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>غطاء زجاجي شريحة</td><td>فيشر Scientific</td><td>12-542B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات كاناميسين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات المغنيسيوم شهادة AC</td><td>فيشر سخان المجهر XXM63SP3KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>العلمي World Precision Instruments</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة</td><td>فيشر Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III المرحلة</td><td>السابقة</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مكعب مرشح أحمر</td><td>Chroma</td><td>Ex: ET560 / 40X ، Em: ET645 / 75M</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire 561 LP شريحة 1170412</td><td></td><td></td><td>متماسكة</td></tr><tr><td>ليزر ، مجهر</td><td>فيشر Scientific</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>الثيامين هيدروكلوريد</td><td>سيجما ألدريتش (SIAL)</td> <td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 إطلاق ليزر</td><td>نيكون</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مكعب مرشح أصفر</td><td>كروما</td><td>على سبيل المثال: Z514 / 10X ، Em: ET535 / 30M</td><td></td></tr></tbody></table>

القياس الكمي في الوقت الحقيقي لتأثيرات tnpb المرتبط بعائلة is200 / is605 على نشاط transposon

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

هنا ، تم تحديد بروتوكول لإجراء تصوير مباشر في الوقت الفعلي لنشاط العناصر القابلة للنقل في الخلايا البكتيرية الحية باستخدام مجموعة من مراسلي الفلورسنت المقترنة بالنقل. على وجه الخصوص ، يوضح كيف يمكن استخدام التصوير في الوقت الفعلي لتقييم آثار البروتين الملحق TnpB على نشاط العنصر القابل للنقل IS608 ، وهو عضو في عائلة IS200 / IS605 من العناصر القابلة للنقل. عائلة IS200 / IS605 من العناصر القابلة للنقل هي عناصر متحركة وفيرة متصلة بأحد أكثر الجينات التي لا تعد ولا تحصى الموجودة في الطبيعة ، tnpB. تقترح تماثلات التسلسل أن بروتين TnpB قد يكون مقدمة تطورية لأنظمة CRISPR / Cas9. بالإضافة إلى ذلك ، تلقى TnpB اهتماما متجددا ، بعد أن ثبت أنه يعمل كنوكلياز داخلي للحمض النووي الريبي يشبه Cas. تم تحديد تأثيرات TnpB على معدلات تبديل IS608 ، وثبت أن تعبير TnpB ل IS608 يؤدي إلى ~ 5x زيادة نشاط الترانسبوزون مقارنة بالخلايا التي تفتقر إلى تعبير TnpB.

هذه الطريقة لتصور نشاط الترانسبوزون في الخلايا الحية بواسطة الفحص المجهري الفلوري ، مع وجود إنتاجية أقل من قياسات التألق السائبة ، تسمح بالتصور المباشر لنشاط الترانسبوزون في الخلايا الحية الفردية. تؤدي أحداث استئصال الترانسبوزون إلى إعادة تكوين المروج ل mCerulean3 (الشكل 1) ، مما يسمح بتحديد الخلايا التي تخضع لنشاط Transposon عن طريق مضان أزرق ساطع (الشكل 2 ، TnpB +: الفيلم التكميلي 1 و TnpB-: الفيلم التكميلي 2). 
<p class=...

تم تحديد بروتوكول لإجراء تصوير مباشر في الوقت الفعلي لتحديد كيفية تأثير البروتين الملحق TnpB على ديناميكيات التحويل في خلايا الإشريكية القولونية الحية الفردية.

القياس الكمي في الوقت الحقيقي لتأثيرات TnpB المرتبط بعائلة IS200 / IS605 على نشاط Transposon

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

يسمح لنا هذا البروتوكول بتحديد إحصائيات الاستئصال على أساس خلية واحدة ، بدلا من النظر إلى السلوك بالجملة. في هذا المستوى ، يمكننا تتبع سلوك الخلايا الفردية بمرور الوقت ، بما في ذلك مستويات TnpA و TnpB للخلايا التي تستأصل مقابل الخلايا التي لا تفعل ذلك ، والتي يمكن أن تسمح لنا ، على سبيل المثال ، بقياس آثار الأحداث الطفرية المحددة على معدل النمو. هذه الطريقة هي طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لقياس ديناميكيات طفرات الخلايا الحية.النهج العام قابل للتطبيق على أي نظام يتطلب التصوير الفلوري للخلايا الحية. تحضير شريحة عن طريق غلي M63 مع 0.5 ٪ الجلوكوز و 1.5 ٪ agarose في الميكروويف لإذابة agarose. تأكد من ذوبان الوسط تماما وخلطه جيدا.اترك الخليط يبرد إلى 55 درجة مئوية قبل إضافة المضادات الحيوية والمحرضات. ضع شريحة مجهر على طاولة العمل. قم بتكديس شريحة واحدة بشكل عمودي على الأولى.تأكد من وجود فجوة تساوي سمك شريحة واحدة بين الشريحة السفلية والعلوية. ماصة ملليلتر واحد من خليط الأغاروز M63 في الفجوة بين الشريحة ببطء لإنشاء مربع هلام صغير. بمجرد أن يتجمد الجل ، حرك الشريحة العلوية لإزالته.تقليم وسادة agarose بشفرة حلاقة أو سكين. ثم ، ماصة 2.5 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية ووضع غطاء زلة على القمة. أغلق المسافة بين الشريحة وانزلاق الغطاء باستخدام الإيبوكسي.اترك الإيبوكسي يجف وتستقر الخلايا على وسادة الأغاروز لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. ضع العينة المحضرة على مجهر مضان في بيئة يتم تسخينها وصيانتها عند 37 درجة مئوية. لكل طول موجي ، ابحث عن مجال الرؤية الذي يحتوي على الحد الأدنى من التألق.قم بإعداد بروتوكول للحصول على الصور في شبكة بأطوال موجية مختلفة وعلى فترات زمنية منتظمة. تؤدي أحداث استئصال Transposon إلى إعادة تكوين المروج ل mCerulean3 ، مما يسمح بتحديد الخلايا التي تخضع لنشاط Transposon عن طريق التألق الأزرق الساطع. TnpB يعزز معدل استئصال الترانسبوزون.تشهد الخلايا التي تعبر عن البروتين التبعي TnpB مستويات أعلى بأربع إلى خمس مرات من نشاط الترانسبوزون مقارنة بالخلايا السلبية TnpB. في الخلايا الإيجابية TnpB ، تحتوي الخلايا التي تخضع لأحداث استئصال الترانسبوزون على مستويات تعبير أعلى من mCherry TnpB من عامة السكان. علاوة على ذلك ، بالنسبة للخلايا التي تخضع لأحداث الاستئصال ، تعبر الخلايا الإيجابية TnpB عن مستويات أعلى بشكل هامشي فقط من TnpA-transposase الوريدي من الخلايا السلبية TnpB ، وهي أعلى من التألق الأصفر لعامة السكان.المكان الأكثر احتمالا للنضال هو إعداد ثقافة الخلية للتجربة. يجب عليك التأكد من نمو الخلايا إلى الطور الأسي وأن الشريحة ملقحة بعدد مناسب من الخلايا. تذكر أن تنتبه للفقاعات عند إغلاق الشريحة حتى لا يجف جل الأغاروز.

real-time-quantification-effects-is200is605-family-associated-tnpb-on

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

المصدر: Kazi ، M. I. ، وآخرون ، إنشاء مكتبات إدخال الينقولات في البكتيريا سالبة الجرام من أجل تسلسل عالي الإنتاجية. J. Vis. خبرة. (2020)يوضح هذا الفيديو اختيار وقياس وحفظ البكتيريا المتلقية سالبة الجرام التي تحمل إدخالات الينقولات بناء على مقاومة الكاناميسين.

عزل البكتيريا سالبة الجرام مع إدخالات الينقولات الجينومية

نحن هنا وصف بروتوكول باستخدام بحار بوساطة الطفرات ينقول مصغرة himar1 لتوليد مكتبة متحولة عالية الكثافة الإدراج إلى الشاشة، وعزل وتحديد الجينات رواية المنظمين في prototypic الزائفة الزنجارية سلالة PAO1.

تحديد جينات جديدة ترتبط مع الجينات في الإنتاج<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; استخدام ميني<em&gt; himar1</em&gt; مارينر الطفرات ينقول بوساطة

الأمعائية س. YSU تنمو في الجلوكوز الحد الأدنى من الأملاح المتوسطة. يتم إنشاء Auxotrophs عن طريق تحويل ذلك مع transposome الذي إدراج نفسها عشوائيا في جينوم المضيف. تم العثور على المسوخ بواسطة الطلاء المتماثلة من المتوسطة معقد إلى الحد الأدنى من المتوسط. يتم تحديد جينات الانقاذ توقفت بسبب الجينات وتسلسلها.

جيل من الأمعائية س. YSU Auxotrophs عن طريق الطفرات ينقول

هنا نوضح سير العمل لاستخدام نظام TetON لتحقيق التعبير الجيني الخاص بالأنسجة في زعنفة ذيل الزرد المتجددة للبالغين.

استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

هنا، استخدمت السلطة من الإدراج عشوائي ينقول بوساطة عنصر الحمض النووي غير الترميز حل موقفها صبغية أمثل.

تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة

قدم هنا طريقة بسيطة لإنشاء مكتبة إدراج ينقول عالي الكثافة في الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري استخدام اقتران جرثومية. هذا البروتوكول يسمح بإنشاء مجموعة من مئات آلاف طفرات فريدة من نوعها في البكتيريا بإدراج الجينوم عشوائي ينقول.

إنشاء "الكثيفة ينقول الإدراج المكتبة استخدام البكتيرية التصريف" في "انتيروباكتيريال سلالات مثل" الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري

يصف لنا هنا أسلوب الذي يجمع بين الطفرات ينقول مع التسلسل الفائق لتحديد وتقدير حجم ينقول ليبتوسبيرال طفرات في الأنسجة بعد تحديا الهامستر. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لطفرات الشاشة للبقاء على قيد الحياة، ونشر في الحيوانات، ويمكن تطبيقها أيضا على الدراسات في المختبر .

التسلسل الفائق موازية "قياس اللياقة البدنية" الإصابة إينتيروجانس Leptospira ينقول الإدراج طفرات خلال الذهبي السوري الهامستر

ويصف هذا البروتوكول وسيلة تحقيق إدماج مورثة فائدة مستقرة في الجينوم البشري نظام النائمة للتنظيم ترانسكريبتيونالي. وترد إعداد التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة، وتوصيل في المختبر للخلايا البشرية والمقايسة الجزيئية في الخلايا ترانسدوسيد.

أسلوب نقل تتسم بكفاءة في المختبر بنظام جمال النوم ترانسكريبتيونالي الخاضعة للتنظيم في متجه تكامل لينتيفيرال معيبة وتعبئتها

نحن وصف طريقة لتوليد مكتبات متحولة تشبع transposon في البكتيريا السلبية الغرام وإعداد لاحقة من مكتبات ابيرليكون الحمض النووي لتسلسل عالية الإنتاجية. على سبيل المثال، ونحن نركز على مسببات الأمراض ESKAPE، Acinetobacter baumannii، ولكن هذا البروتوكول هو قابل لمجموعة واسعة من الكائنات الحية سلبية الغرام.

توليد مكتبات الإدراج Transposon في البكتيريا السلبية الغرامية لتسلسل عالي الإنتاجية

هذه طريقة مكيفة لتحديد عوامل استعمار الحشرات المرشحة في سيمبيونت مفيد Burkholderia. يتم إصابة مضيف الخنفساء بمكتبة متحولة عشوائية تم إنشاؤها عبر تولد الإرسال والاستقبال ، ويتم مقارنة تعقيد المكتبة بعد الاستعمار بعنصر تحكم ينمو في المختبر.

تسلسل إدراج الإرسال والاستقبال كأداة لتوضيح عوامل الاستعمار البكتيرية في بيركهولدريا غلاديولي سيمبيونت من خنافس لاغريا فيلوسا

اكتشف كيفية قياس تأثير بروتين TnpB على نشاط النقل الجيني في خلايا Escherichia coli الحية باستخدام التصوير الفلوري في الوقت الفقيق. يُظهر البروتوكول زيادة النشاط أربع إلى خمس مرات في الخلايا الموجبة لـ TnpB.

القياس الكمي في الوقت الحقيقي لتأثيرات TnpB المرتبط بعائلة IS200 / IS605 على نشاط Transposon

استكشف المزيد من الفيديوهات