في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للمجموعات العصبية في شبكات الخلايا العصبية الحسية الأولية في العقد الجذرية الظهرية السليمة

يصف هذا البروتوكول التعرض الجراحي لعقدة الجذر الظهري (DRG) متبوعا ب GCaMP3 (مؤشر Ca²⁺ المشفر وراثيا; بروتين الفلورسنت الأخضر - كالمودولين - M13 بروتين 3) تصوير Ca²⁺ للمجموعات العصبية باستخدام الفئران Pirt-GCaMP3 أثناء تطبيق مجموعة متنوعة من المحفزات على المخلب الخلفي المماثل.

يسمح عدد الخلايا العصبية التي تتم مراقبتها باستخدام هذه الطريقة بجمع بيانات شبكة الخلايا العصبية التي سيكون من المستحيل استخدامها باستخدام طرق قديمة أو غيرها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على مراقبة ما يقرب من 2،000 خلية عصبية حسية أولية في وقت واحد ، والاستجابة مباشرة للمنبهات المطبقة على المخلب الخلفي. هذا الإجراء مناسب بشكل خاص لدراسة التدخلات العلاجية للألم المحيطي وفرط الحساسية للألم.

يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة العقد مثلثة التوائم أو الجنينية أو استخدامها مع أجهزة استشعار مشفرة وراثيا لجزيئات إشارات الجهد أو الخلية ، مثل AMP الدوري. يتطلب إجراء هذه الجراحة ممارسة. يمكنك التدرب على ما يصل إلى ستة عقد جذر ظهرية على واحد.

سيكون عرض الإجراء ، بمساعدة جون شانونهاوس والسيد روبن جوميز. للبدء ، ضع الماوس على وسادة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. حدد موقع تضخم أسفل الظهر عن طريق الشعور بعظم الحوض للفأر.

ثم احلق الجزء الخلفي من الماوس فوق منطقة تكبير أسفل الظهر. باستخدام المقص ، قم بعمل شق مستطيل من ثلاثة جوانب فوق تضخم أسفل الظهر ، وقم بطي الجلد بعيدا بالملقط. استخدم مقص تشريح الزنبرك 13 ملم لعمل شقوق من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات على الجانب الأيمن من العمود الفقري.

استخدم المقص لقطع الجلد والعضلات إلى الجانبين لكشف العمود الفقري. ثم ، باستخدام مقص ثمانية ملليمترات ، قم بقطع العضلات والأنسجة الضامة لتنظيف العملية المستعرضة للجانب الأيمن L5 DRG. حاول تقليل النزيف باستخدام القطن أو الجلفوم لامتصاص الدم.

قم بقص العملية المستعرضة L5 على الجانب الأيمن باستخدام rongeurs Friedman-Pearson أو ملقط ناعم قوي ، مع الحرص على عدم لمس DRG. بعد ذلك ، حرك الماوس ولوحة التدفئة إلى المسرح المخصص. استخدم شريط المسرح لتثبيت الحيوان ووسادة التدفئة في مكانها.

ضع أنف الحيوان في مخروط الأنف لتخدير الأيزوفلوران المستمر. قم بتأمين المخلب الخلفي الأيمن الذي يبرز إلى موضع خارج المسرح لسهولة تطبيق المحفزات. قم بتثبيت العمود الفقري في مكانه باستخدام مشابك المرحلة على الجلد على الفقرات أو عظم الحوض فقط منقاري وذيلي إلى L5 DRG.

اضبط المشابك والمرحلة لجعل سطح DRG مستويا قدر الإمكان. ثم ضع المرحلة أسفل المجهر بحيث يكون الهدف مباشرة ثمانية ملليمترات فوق DRG عند خفضه. أدخل مقياس حرارة المستقيم.

قم بتوصيل خطوط الكهرباء بوسادة التدفئة ومقياس حرارة المستقيم. قم بتوصيل مخروط الأنف بخطوط غاز الأيزوفلوران. استخدم مجهرا متحد البؤر مستقيما مع هدف 10x 0.4 DIC والبرامج المرتبطة به للتصوير.

استخدم إعدادات مرشح FITC الخضراء للإثارة عند 495 نانومتر ، والانبعاثات عند 519 نانومتر ، والطول الموجي للكشف بين 500 إلى 580 نانومتر. تحت المجهر ، ابحث عن سطح DRG. اضبط المشابك على المسرح بحيث يكون سطح DRG مستويا قدر الإمكان ويتم تصور أقصى مساحة للسطح في المستوى البؤري.

مراقبة الحيوان طوال العملية للحفاظ على التخدير isoflurane دون جرعة زائدة. لتحميل بروتوكول المسح السريع للمجهر ، استخدم الإعدادات النموذجية لحجم voxel 2.496 × 2.496 × 16 ميكرون ، 512 × 512 بكسل ، 10 شريحة بصرية Z-stack ، وحدة Airy واحدة ل 32 ميكرومتر ، 1٪ طاقة ليزر 488 نانومتر وخمسة ملي وات ، وقت البكسل 1.52 ميكروثانية ، وقت الخط 0.91 مللي ثانية ، وقت الإطار 465 مللي ثانية ، سرعة مسح LSM ثمانية ، المسح ثنائي الاتجاه ، كاشف PMT يكسب 650 فولت ، والكسب الرقمي واحد. قم بإجراء مسح قصير من ثماني دورات ل DRG بالنقر فوق بدء التجربة ضمن علامة التبويب الاستحواذ.

قم بإنشاء فيلم عن طريق إجراء عرض متعامد لعمليات المسح الضوئي بمعدل مسح ضوئي واحد لكل إطار بمرور الوقت. تحقق يدويا من وضوح الصورة وعناصر التصوير ، مثل موجات السطوع التي تعبر DRG. اضبط موضع المشبك وسمك المقطع البصري ، وكرر هذه الخطوة حتى يتم تحقيق فيلم واضح وعالي الجودة.

بعد ذلك ، قم بتحميل بروتوكول المسح الضوئي عالي الدقة للمجهر باستخدام الإعدادات النموذجية لحجم voxel 1.248 × 1.248 × 14 ميكرون ، 1024 × 1024 بكسل ، ست شرائح بصرية Z-stack ، وحدة تهوية 1.2 أو 39 ميكرومتر ، 5٪ طاقة ليزر 488 نانومتر و 25 ملي واط ، وقت البكسل 2.06 ميكروثانية ، وقت الخط 4.95 مللي ثانية ، وقت الإطار 5.06 ثانية ، سرعة مسح LSM ستة ، المسح ثنائي الاتجاه ، كسب كاشف PMT عند 650 فولت ، والكسب الرقمي واحد. انقر فوق الزر "بدء التجربة" ضمن علامة التبويب "الاستحواذ" لعمل صورة عالية الدقة ل DRG. قم بتحميل بروتوكول المسح السريع للمجهر ، وسجل النشاط التلقائي في DRG لمدة 80 دورة.

قم بإنشاء فيلم إسقاط متعامد ، وتحقق من أن الصورة ذات جودة كافية للتحليل. لتطبيق المحفزات ، اضبط المجهر لإجراء 15 إلى 20 عملية مسح. انتظر حتى تكتمل عمليات الفحص من واحد إلى خمسة لإنتاج خط الأساس.

ضع التحفيز أثناء عمليات المسح من ستة إلى 10. انتظر خمس دقائق على الأقل بعد كل مثير قبل تطبيق التحفيز التالي لمنع إزالة الحساسية. للضغط الميكانيكي ، أمسك قرصة algometer بمخلب بين المجاذيف دون لمس المخلب.

اضغط على المخلب بدءا من نهاية الفحص الخامس مباشرة وتوقف فورا بعد الفحص 10. راقب قوة الضغط باستخدام مقياس algmeter ، وتأكد من أنها لا تتجاوز 10 جم فوق القوة المطلوبة. بالنسبة للمحفزات الحرارية ، سخني كوبا من الماء إلى أعلى بقليل من درجة الحرارة المطلوبة.

عندما يكون الماء في درجة الحرارة الصحيحة ، قم بتطبيق التحفيز مباشرة بعد المسح الخامس عن طريق غمر المخلب في الماء. اسحب الدورق بعيدا فورا بعد الفحص 10. سمح التعرض الجراحي ل L5 DRG متبوعا بالفحص المجهري متحد البؤر بتصوير ما يصل إلى 1،800 خلية عصبية في وقت واحد باستخدام الفئران Pirt-GCaMP3.

لوحظت الخلايا العصبية الحسية الأولية في مجموعة على مستوى السكان لعابرات الكالسيوم العفوية في غياب المنبهات واستجابة للمنبهات في سياقها الفسيولوجي الطبيعي. زادت المحفزات القوية أو الحرارة الضارة من استجابات الكالسيوم. مقارنة بالضغط ب 100 جم ، أدى الضغط ب 300 جم إلى زيادة عدد الخلايا العصبية التي تنتج عابرات الكالسيوم ومنطقة دلتا F بواسطة F0 تحت المنحنى.

زادت الحرارة الدافئة في نطاق درجة حرارة غير ضارة من 21 و 45 درجة مئوية من عدد الخلايا العصبية التي تنتج عابرات الكالسيوم ومنطقة دلتا F بواسطة F0 تحت المنحنى. أدت درجات الحرارة غير الضارة إلى تنشيط عدد أقل من الخلايا العصبية التي تنتج عابرات مقارنة بمحفز حراري ضار عند 57 درجة مئوية. علاوة على ذلك ، أنتجت الخلايا العصبية ذات القطر الأصغر والمتوسط الكالسيوم العابر تلقائيا وتحت جميع المحفزات ، لكن الخلايا العصبية ذات القطر الأكبر أنتجت فقط عابرات الكالسيوم استجابة لمحفز الضغط 300 جم.

يجب أن يكون DRG مستويا وسمك شريحة بصرية مثالي. يجب أن يكون بحيث يمكنك اكتشاف الحد الأقصى لعدد الخلايا وليس هناك تموج في الفيلم. تم استخدام هذه التقنية لتحليل الطرائق الحسية على المستوى السكاني للإحساس الجسدي والذوق ولدراسة الخلايا العصبية المجاورة التي تنشط في أزواج أو في مجموعات متزامنة تساهم في الألم المزمن والاعتلال العصبي.