DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

Changyue Liu; Zhengyang Lei; Lijin Lian; Likun Zhang; Zhicheng Du; Peiwu Qin

doi:10.3791/64833

نظام الكشف عن فيروسات الحمض النووي استنادا إلى تقنية RPA-CRISPR/Cas12a-SPM والتعلم العميق

JoVE Journal
Biology
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

نظام الكشف عن فيروسات الحمض النووي استنادا إلى تقنية RPA-CRISPR/Cas12a-SPM والتعلم العميق

Full Text

1,432 Views

04:17 min

May 10, 2024

DOI: 10.3791/64833-v

Changyue Liu*^1,2, Zhengyang Lei*^1,2, Lijin Lian², Likun Zhang^1,2, Zhicheng Du^1,2, Peiwu Qin^1,2

¹Center of Precision Medicine and Healthcare,Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, ²Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering,Tsinghua Shenzhen International Graduate School

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a rapid and sensitive detection system for frog virus 3, emphasizing the integration of recombinase polymerase amplification (RPA) with the CRISPR/Cas12a system to enable point-of-care detection of DNA viruses. This innovative method aims to enhance detection accuracy and efficiency, which is crucial in preventing potential pandemic outbreaks.

Key Study Components

Research Area

Molecular biology
Pathogen detection
Point-of-care diagnostics

Background

The significance of rapid viral detection in preventing pandemics.
Integration of advanced methodologies like RPA and CRISPR technology.
The role of portable systems in field-ready diagnostic assessments.

Methods Used

Recombinase polymerase amplification (RPA)
CRISPR/Cas12a system
Smartphone-based microscopy with AI-assisted classification

Main Results

Significant differentiation between 10 aM FV3 and control samples.
Enhanced detection accuracy through the use of specific primers and CRISPR RNA.
Potential for adapting the method for other DNA viruses by modifying CRISPR RNA.

Conclusions

The study demonstrates an efficient portable detection method for DNA viruses.
This approach is relevant for timely protective measures in the breeding industry, illustrating its importance in biological research and public health.

Frequently Asked Questions

What is the primary application of this detection system?

The system is designed for point-of-care detection of DNA viruses, enabling rapid diagnostic results.

Which virus is primarily studied in this protocol?

Frog virus 3 is the main focus of the detection method outlined in this study.

How does the integration of RPA and CRISPR/Cas12a improve detection?

This integration enhances efficiency and accuracy while minimizing human error in the detection process.

What technological innovations are used in this protocol?

The protocol utilizes a portable smartphone microscope and AI-assisted classification for analyzing results.

Can the methodology be adapted for other viruses?

Yes, the CRISPR RNA can be modified to target other DNA viruses, making the technique versatile.

What is the significance of this study in terms of public health?

Timely detection and effective responses to viral outbreaks can help mitigate economic losses and health risks in breeding industries.

What role does AI play in the detection process?

AI assists in classifying the results obtained from the smartphone microscopy images, thus improving accuracy.

نقدم بروتوكولا يجمع بين تضخيم بوليميراز المؤتلف ونظام CRISPR / Cas12a للكشف عن تتبع فيروسات الحمض النووي ويبني مجهرا محمولا للهواتف الذكية مع تصنيف مدعوم بالذكاء الاصطناعي للكشف عن فيروس الحمض النووي في نقطة الرعاية.

يقدم بروتوكولنا نظام كشف سريع وحساس للغاية لفيروس الضفدع 3. ومن الجدير بالذكر أن هذه الطريقة تمكن من الكشف عن فيروسات الحمض النووي في نقاط الرعاية ، وتلعب دورا حاسما في منع حدوث الأمراض الوبائية. تكمن الميزة الأساسية لهذه التقنية في دمجها لتقنية RPA مع نظام CRISPR / Cas12a ، الذي يكمله مجهر محمول قائم على الهاتف الذكي وتصنيف الذكاء الاصطناعي.

يعزز هذا التكامل بشكل كبير كفاءة الكشف ودقته مع تقليل الأخطاء المنسوبة إلى العوامل البشرية في نفس الوقت. للبدء ، أضف إنزيمات RPA الرئيسية الأربعة في المخزن المؤقت للتفاعل. ثم أضف الاشعال المصممة مسبقا إلى الخليط.

دوامة الخليط جيدا. أضف ميكرولترا واحدا من الحمض النووي المستهدف الذي تم الحصول عليه من فيروس الضفدع 3 إلى كل تفاعل RPA ، ودوامة للخلط جيدا. بعد ذلك، ماصة سبعة ميكرولترات من 100 مليمول كلوريد المغنيسيوم لبدء التفاعل.

احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإكمال الفحص. تحضير بروتين بكتيريا Lachnospiraceae CAS12a مع CRISPR RNA لتشكيل مجمعات وظيفية. امزج البروتين البكتيري و 10 × كريسبر / كاس 12 أ عازلة للتفاعل.

أضف الآن 500 مسبار مراسل نانوي أحادي الشريط من الحمض النووي. أضف ميكرولترا واحدا من منتج تفاعل RPA إلى خليط تفاعل CRISPR / Cas12a CRISPR RNA. احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

قم بقياس إشارات الفلورسنت باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. للكشف باستخدام مجهر الهاتف الذكي ، أولا ، ماصة خليط التفاعل المحضر على شريحة زجاجية منسحبة. ثم قم بتغطيته بغطاء قبل الحضانة.

ضع الشريحة على مسرح مجهر الهاتف الذكي ، واضبط البعد البؤري والوضوح. التقط صورة لقياس إشارات الفلورسنت. استخدم ImageJ لقياس متوسط القيمة الرمادية لكل صورة والانحراف المعياري لمتوسط القيمة الرمادية في مجموعة تركيز.

اعتماد نموذج التعلم العميق AlexNet 33 للتصنيف. الآن استخدم Python لإعادة تشكيل الصور المدخلة إلى 224 × 224 بواسطة ثلاث قنوات. أخيرا ، استخدم شبكة أساسية مدربة مسبقا مع مجموعة بيانات ImageNet لاستخراج ميزات الصورة.

قدم الزوج السادس من الاشعال أقصى كفاءة تضخيم ، وتم اختياره. أثبتت كريسبر RNA-3 أنها الأكثر كفاءة للانقسام الجانبي. أدى استخدام نظام كشف مطور مع بادئات RPA مختارة و CRISPR RNA إلى اختلافات كبيرة بين 10 aM FV3 والتحكم.

النقطة الأكثر أهمية التي يجب تذكرها هي خطوة اكتشاف CAS 12a المحددة. يمكن تعديل أو إعادة تصميم الحمض النووي الريبي كريسبر للتفاعل لاستهداف فيروسات الحمض النووي الأخرى بناء على اكتشاف CAS 12a. يمكن أن تساعد الطريقة المقترحة في التقييم الأولي لكمية الفيروس المستهدف.

بناء على ذلك ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل qPCR للحصول على حمل فيروسي أكثر دقة. توفر هذه التقنية محاولة أولية نحو الكشف المحمول عن فيروسات الحمض النووي. أما بالنسبة لفيروس الضفدع 3 المستخدم في هذا البروتوكول ، فإن الكشف في الوقت المناسب يمكن أن يؤدي إلى اتخاذ تدابير وقائية فعالة ، مما يقلل من الخسائر في صناعة التربية.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos

Explore More Videos

علم الأحياء العدد 207 فيروس الحمض النووي كريسبر/كاس 12a تقنية RPA الفحص المجهري للهواتف الذكية التعلم العميق