نظام الكشف عن فيروسات الحمض النووي استنادا إلى تقنية RPA-CRISPR/Cas12a-SPM والتعلم العميق
مايو 10, 2024
نقدم بروتوكولا يجمع بين تضخيم بوليميراز المؤتلف ونظام CRISPR / Cas12a للكشف عن تتبع فيروسات الحمض النووي ويبني مجهرا محمولا للهواتف الذكية مع تصنيف مدعوم بالذكاء الاصطناعي للكشف عن فيروس الحمض النووي في نقطة الرعاية.
يقدم بروتوكولنا نظام كشف سريع وحساس للغاية لفيروس الضفدع 3. ومن الجدير بالذكر أن هذه الطريقة تمكن من الكشف عن فيروسات الحمض النووي في نقاط الرعاية ، وتلعب دورا حاسما في منع حدوث الأمراض الوبائية. تكمن الميزة الأساسية لهذه التقنية في دمجها لتقنية RPA مع نظام CRISPR / Cas12a ، الذي يكمله مجهر محمول قائم على الهاتف الذكي وتصنيف الذكاء الاصطناعي.
يعزز هذا التكامل بشكل كبير كفاءة الكشف ودقته مع تقليل الأخطاء المنسوبة إلى العوامل البشرية في نفس الوقت. للبدء ، أضف إنزيمات RPA الرئيسية الأربعة في المخزن المؤقت للتفاعل. ثم أضف الاشعال المصممة مسبقا إلى الخليط.
دوامة الخليط جيدا. أضف ميكرولترا واحدا من الحمض النووي المستهدف الذي تم الحصول عليه من فيروس الضفدع 3 إلى كل تفاعل RPA ، ودوامة للخلط جيدا. بعد ذلك، ماصة سبعة ميكرولترات من 100 مليمول كلوريد المغنيسيوم لبدء التفاعل.
احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإكمال الفحص. تحضير بروتين بكتيريا Lachnospiraceae CAS12a مع CRISPR RNA لتشكيل مجمعات وظيفية. امزج البروتين البكتيري و 10 × كريسبر / كاس 12 أ عازلة للتفاعل.
أضف الآن 500 مسبار مراسل نانوي أحادي الشريط من الحمض النووي. أضف ميكرولترا واحدا من منتج تفاعل RPA إلى خليط تفاعل CRISPR / Cas12a CRISPR RNA. احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
قم بقياس إشارات الفلورسنت باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. للكشف باستخدام مجهر الهاتف الذكي ، أولا ، ماصة خليط التفاعل المحضر على شريحة زجاجية منسحبة. ثم قم بتغطيته بغطاء قبل الحضانة.
ضع الشريحة على مسرح مجهر الهاتف الذكي ، واضبط البعد البؤري والوضوح. التقط صورة لقياس إشارات الفلورسنت. استخدم ImageJ لقياس متوسط القيمة الرمادية لكل صورة والانحراف المعياري لمتوسط القيمة الرمادية في مجموعة تركيز.
اعتماد نموذج التعلم العميق AlexNet 33 للتصنيف. الآن استخدم Python لإعادة تشكيل الصور المدخلة إلى 224 × 224 بواسطة ثلاث قنوات. أخيرا ، استخدم شبكة أساسية مدربة مسبقا مع مجموعة بيانات ImageNet لاستخراج ميزات الصورة.
قدم الزوج السادس من الاشعال أقصى كفاءة تضخيم ، وتم اختياره. أثبتت كريسبر RNA-3 أنها الأكثر كفاءة للانقسام الجانبي. أدى استخدام نظام كشف مطور مع بادئات RPA مختارة و CRISPR RNA إلى اختلافات كبيرة بين 10 aM FV3 والتحكم.
النقطة الأكثر أهمية التي يجب تذكرها هي خطوة اكتشاف CAS 12a المحددة. يمكن تعديل أو إعادة تصميم الحمض النووي الريبي كريسبر للتفاعل لاستهداف فيروسات الحمض النووي الأخرى بناء على اكتشاف CAS 12a. يمكن أن تساعد الطريقة المقترحة في التقييم الأولي لكمية الفيروس المستهدف.
بناء على ذلك ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل qPCR للحصول على حمل فيروسي أكثر دقة. توفر هذه التقنية محاولة أولية نحو الكشف المحمول عن فيروسات الحمض النووي. أما بالنسبة لفيروس الضفدع 3 المستخدم في هذا البروتوكول ، فإن الكشف في الوقت المناسب يمكن أن يؤدي إلى اتخاذ تدابير وقائية فعالة ، مما يقلل من الخسائر في صناعة التربية.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة نظام كشف سريع وحساس لفيروس الضفادع 3، مع التركيز على دمج تضخيم البوليميراز المعتمد على الريكومبينيز (RPA) مع نظام CRISPR/Cas12a لتمكين الكشف في نقاط الرعاية عن فيروسات الحمض النووي DNA. تهدف هذه الطريقة المبتكرة إلى تعزيز دقة وكفاءة الكشف، وهو أمر بالغ الأهمية في منع تفشي الأوبئة المحتملة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- البيولوجيا الجزيئية
- الكشف عن المسببات المرضية
- التشخيص في نقطة الرعاية
خلفية علمية
- أهمية الكشف السريع عن الفيروسات في منع الجوائح.
- دمج المنهجيات المتقدمة مثل تقنية RPA وتقنية CRISPR.
- دور الأنظمة المحمولة في تقييمات التشخيص الجاهزة للاستخدام الميداني.
الطرق المستخدمة
- تضخيم البوليميراز المعتمد على ريكومبيناز (RPA)
- نظام CRISPR/Cas12a
- المجهر القائم على الهاتف الذكي مع التصنيف بمساعدة الذكاء الاصطناعي
النتائج الرئيسية
- تمايز ملحوظ بين عينات FV3 بتركيز 10 aM وعينات التحكم.
- تعزيز دقة الكشف من خلال استخدام بادئات محددة وCRISPR RNA.
- إمكانية تطويع هذه الطريقة لفيروسات DNA أخرى عن طريق تعديل CRISPR RNA.
الاستنتاجات
- توضح الدراسة طريقة كشف محمولة وفعالة للفيروسات التي تحتوي على DNA.
- يعتبر هذا النهج ذا أهمية لاتخاذ تدابير وقائية في الوقت المناسب في صناعة التربية، مما يبرز أهميته في الأبحاث البيولوجية والصحة العامة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تعد أنظمة الكشف السريع والمحمولة عن الفيروسات ذات الحمض النووي DNA ضرورية للتدخل المبكر والاحتواء في كل من إعدادات الأبحاث والصناعات الدوائية الحيوية التطبيقية. يتيح دمج تقنية RPA-CRISPR/Cas12a مع المجهر المعتمد على الهواتف الذكية والتعلم العميق كشفاً حساساً ومحدداً للتسلسل في نقطة الرعاية، مما يقلل الاعتماد على المختبرات المركزية. ويدعم هذا النهج تسريع عملية اتخاذ القرار وتخفيف المخاطر عبر مسارات الاكتشاف والبحوث الترجمية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء السريع لأهداف الحمض النووي الفيروسي (viral DNA) لتقليل المخاطر الميكانيكية.
- يدعم التحقق الوظيفي من كواشف الكشف والحمض النووي الريبوزي الموجه لـ CRISPR (CRISPR guide RNAs).
- يسهل عملية الفرز في المراحل المبكرة لأنظمة الكشف المرشحة من أجل تطوير المحفظة البحثية.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر قراءة كمية وموحدة لتحسين المقايسة والتحقق من صحتها.
- يمكّن من سير عمل للكشف قابل للتكرار والتوسيع، بما يتناسب مع الفرز عالي الإنتاجية.
- يدعم المقارنة القوية لكفاءة البادئ وRNA الخاص بنظام CRISPR لتحسين المقايسة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يتماشى مع استراتيجيات المؤشرات الحيوية الترجمية من خلال تمكين الكشف عن الفيروسات في الميدان.
- يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من خلال مخرجات كمية محمولة.
- يقلل من المخاطر البيولوجية من خلال تمكين الكشف والتدخل في الوقت المناسب في النماذج ذات الصلة.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
يربط هذا النظام بين مراحل الاكتشاف المبكر، وتطوير المقايسات، والبحوث الترجمية، من خلال توفير منصة كشف كمية محمولة قابلة للتكيف مع فيروسات DNA المتعددة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات والتحقق من الأهداف من خلال الكشف النوعي عن التسلسلات.
- المسح: توفر مخرجات فلورية كمية وقابلة للتكرار لتوحيد معايير المقايسة.
- التحليلات: تدمج التصنيف القائم على التعلم العميق لتفسير النتائج بموضوعية وثقة عالية.
- الأبحاث الانتقالية: تتيح الكشف السريع والجاهز للاستخدام الميداني لدعم الدراسات قبل السريرية ودراسات المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر منصة نموذجية قابلة للتكيف مع أهداف فيروسية جديدة من خلال إعادة تصميم أدلة CRISPR RNA.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الآلي في الكشف عن الفيروسات.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع في سير عمل عمليات الكشف.
- القيمة الاستراتيجية: تسرع اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف، وتقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والتقدم السريع لتقنيات الكشف.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في البيولوجيا الجزيئية وتصميم مقايسات CRISPR.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة تصوير محمولة وبنية تحتية حاسوبية لتحليلات الذكاء الاصطناعي.
- يستلزم توحيد بروتوكولات المقايسات وتفسير البيانات بين الفرق المختلفة.
- قابل للتكيف مع فيروسات DNA المختلفة عن طريق تعديل تسلسلات CRISPR RNA.
- يعتمد على التحقق الأولي من الصحة قبل النشر في بيئات ميدانية متنوعة.
الأسئلة الشائعة حول المستحضرات الصيدلانية الحيوية
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:40
Combining Recombinase Polymerase Amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a Systems for the Detection of DNA Viruses
1:20
CRISPR/Cas12a Detection With/Without Smartphone Microscopy (SPM)
2:23
Data Augmentation and Transfer Learning
2:58
Results: AI-Detection of DNA Virus Using RPA-CRISPR/Cas12a-SPM
3:26
Conclusion
![تصوير [كنفوكل] الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ونمط الاعتراف مستقبلات في الإصابة بفيروسات الرنا الشعور السلبي](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59095.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A20.513Z&w=384&q=75)
