الكشف القائم على التلوين المناعي للتغيرات الديناميكية في بروتينات خلايا الدم الحمراء
March 17th, 2023
يشكل التقاط التغيرات الديناميكية في تنشيط البروتين لخلايا الدم الحمراء المنزوعة النواة تحديات منهجية ، مثل الحفاظ على التغييرات الديناميكية للمنبهات الحادة لتقييمها لاحقا. يصف البروتوكول المقدم تقنيات تحضير العينات وتلطيخها التي تمكن من حفظ وتحليل تغيرات البروتين ذات الصلة والكشف اللاحق.
تجعل طريقتنا التحقيقات تحت الخلوية الآلية ممكنة في مجال البيولوجيا الميكانيكية سريع الحركة عن طريق تثبيت تعديلات البروتين المؤقتة في مكانها ثم اكتشافها بأجسام مضادة محددة. هذه الطريقة سهلة التطبيق من الناحية الفنية. النتائج صالحة للغاية وقابلة للتكرار.
أيضا ، بالمقارنة مع التقنيات الأخرى ، يمكن حقا استخدام طريقتنا بشكل فعال في المجال الناشئ لإشارات خلايا الدم الحمراء بعد الترجمة ، والتي تعتمد على تعديلات البروتين المؤقتة ، وخاصة الإشارات الميكانيكية للخلايا الحمراء. لإجراء تثبيت بروتين كرات الدم الحمراء ، قم بتخفيف الدم الكامل بنسبة واحد إلى اثنين في محلول بارافورمالدهايد 4٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي محلول الدم عند 132 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وإزالة المادة الطافية بعناية.
أعد تعليق حبيبات كرات الدم الحمراء في مجلدين من 0.1 مولار PBS ، واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، قم بطرد العينة ، وإزالة المادة الطافية قبل تعليق حبيبات كرات الدم الحمراء في حجم واحد من 0.1 مولار PBS. قم بتسمية شريحة مجهر بمعرف العينة والجسم المضاد المطبق باستخدام قلم مقاوم للكحول.
أضف 10 ميكرولتر من محلول كرات الدم الحمراء المحضر. ضع شريحة ثانية على العينة بزاوية 45 درجة ووزع العينة بالتساوي على طول الشريحة. ثبت الشريحة بالحرارة عن طريق تحريك العينة فوق موقد بنسن بحركة ثابتة لمدة خمس إلى سبع ثوان.
بالنسبة لتلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، قم بتمييز المنطقة 2/3 من الشريحة كاختبار و 1/3 كعنصر تحكم باستخدام قلم رصاص شحم. ثم اغسل مناطق العينة مرتين عن طريق تطبيق TBS لمدة 30 ثانية. بعد الغسيل الثاني ، أضف 0.1٪ تربسين ، وقم بتغطية الشريحة باستخدام غرفة حضانة مصممة لهذا الغرض بغطاء.
احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. املأ الكأس الزجاجية بماء الصنبور وأوقف تفاعل الإنزيم بإضافة ماء الصنبور من الكأس الزجاجية إلى الشريحة. اسكب المحلول ، واغسل كلا المنطقتين ثلاث مرات باستخدام TBS.
بعد الغسيل النهائي ، أضف محلول حجب البيروكسيديز ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اسكب المحلول واغسل كلا المنطقتين ثلاث مرات باستخدام TBS. ثم يضاف 3٪ محلول الحليب الخالي من الدسم ويحتضن لمدة 30 دقيقة.
بعد الحضانة ، اسكب المحلول ، وأضف محلول الأجسام المضادة الأساسي إلى منطقة الاختبار. أضف محلول التحكم في الأجسام المضادة إلى منطقة التحكم. احتضان العينات عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي ، اسكب محلول الأجسام المضادة واغسل كلا المنطقتين ثلاث مرات باستخدام TBS. ثم أضف 3٪ محلول مصل الماعز العادي لمنع الارتباط غير المحدد واحتضانه لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف محلول ثانوي للأجسام المضادة واحتضانه لمدة 30 دقيقة.
اسكب محلول الأجسام المضادة واغسل المناطق ثلاث مرات باستخدام TBS قبل الشروع في تطوير التلطيخ. بعد ذلك ، لتنفيذ تفاعل بيروكسيديز الفجل المقترن بالأفيدين ، أضف محلول بيروكسيديز أفيدين المخفف واحتضانه لمدة 30 دقيقة. ضع الشريحة تحت المجهر عند تكبير 200 مرة ، وأضف حل DAB المحضر حديثا إلى كلا المنطقتين.
راقب تلطيخ كرات الدم الحمراء بشكل مستمر ، وأوقف التلوين عن طريق إزالة محلول DAB باستخدام ماصة يمكن التخلص منها قبل أن تبدأ الخلفية في التلوين. لإجراء تجفيف العينة، ضع الشريحة في رف زجاجي واغمرها لمدة خمس ثوان في زيادة تركيزات الإيثانول، وأخيرا في الزيلول. بعد الجفاف ، ضع الشريحة على المناديل الورقية مع كرات الدم الحمراء في الأعلى لامتصاص السائل الزائد.
أضف قطرتين أو ثلاث قطرات من وسيط التثبيت على قسيمة الغطاء وقم بتغطية الشريحة باستخدام قسيمة الغطاء. للتصور والتصوير ، ضع الشريحة في مجهر ضوئي مرسل مقترن بكاميرا. قم بتشغيل مصدر الضوء والكاميرا وابدأ تشغيل البرنامج.
ضمن وضع المجال الساطع ، ركز كرات الدم الحمراء عن طريق تدوير مقابض ضبط التركيز البؤري الخشنة والدقيقة. وبالمثل ، ركز كرات الدم الحمراء تحت وضع الفلورسنت. لتحليل قيمة RBC الرمادية، ضع علامة على حافة كل RBC باستخدام أداة التحديد البيضاوي داخل برنامج ImageJ.
باستخدام الأمر قياس، قم بقياس القيم الرمادية ل 50 كرات الدم الحمراء من الاختبار و10 كرات الدم الحمراء من عنصر التحكم. من أجل تلطيخ بروتينات كرات الدم الحمراء المناعية ، احتضان العينة بجسم مضاد ثانوي مقترن بالفلورسنت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مما يحميها من الضوء. بعد الحضانة ، اسكب محلول الأجسام المضادة واغسل الشريحة ثلاث مرات باستخدام TBS.
اترك TBS على العينة بعد الغسيل النهائي. قم بتجفيف العينة وإعداد الشريحة بقسيمة غطاء للتقييم المجهري كما هو موضح. قم بتشغيل المجهر ومصدر ضوء الفلورسنت ، وركز كرات الدم الحمراء تحت وضع المجال الساطع.
التقط صورا ساطعة المجال وفلورسنت في ثلاث مناطق متميزة على الأقل من منطقة اختبار الشريحة المحددة عشوائيا. اضبط وقت التعريض الضوئي على ثانية واحدة لصور الفلورسنت والتقط صورة. ثم قم بالتبديل إلى وضع المجال الساطع ، واضبط وقت التعرض على تلقائي ، والتقط صورة المجال الساطع المقابلة.
احفظ الصور بتنسيق TIFF. التقط صورا فلورية وساطعة المجال في منطقتين متميزتين على الأقل تم اختيارهما عشوائيا في منطقة التحكم في الشريحة. احفظ الصور بتنسيق TIFF للحفاظ على القيم الرمادية الأصلية للبكسل، ومنع الضغط، وحمل البيانات الوصفية للاكتساب.
لقياس القيم الرمادية لكرات الدم الحمراء الملتقطة ، افتح ImageJ. ضع علامة على كل خلية باستخدام أداة التحديد البيضاوي، وقم بتحليلها باستخدام أمر القياس. قم بتمييز ما بين ثلاث وخمس مناطق خالية من كرات الدم الحمراء وحدد القيم الرمادية لقياس إشارة الخلفية.
لإجراء تحليل بيانات بديل للصور الملتقطة، قم بإنشاء أمر ماكرو من خلال إصدار فيجي من ImageJ للتحديد التلقائي وتصحيح الخلفية وتحليل القيمة الرمادية لصورة معينة. افتح صورة بتنسيق TIFF للتحليل في فيجي. ثم افتح مضان كرات الدم الحمراء.
ماكرو ijm، وانقر فوق تشغيل. تم تقييم إشارة الأجسام المضادة المستهدفة ضد سينسيز أكسيد النيتريك RBC ، أو NOS ، المفسفرة في بقايا سيرين 1177 أثناء الراحة واستجابة للتعرض للقوة الميكانيكية باستخدام كل من الكيمياء الهيستولوجية المناعية والتألق المناعي. تم الكشف عن زيادة بمقدار ثلاثة أضعاف في إشارة الأجسام المضادة المستهدفة ضد RBC-NOS المفسفرة في بقايا سيرين 1177 استجابة للتعرض للقوة الميكانيكية لكرات الدم الحمراء مقارنة بالخلايا غير المنفصمة المعنية عند تقييمها إما بطريقة الكيمياء المناعية أو المناعية.
يحتاج المستخدم إلى التأكد من تطبيق الجسم المضاد فقط على منطقة الاختبار. خلاف ذلك ، لا يمكن تحليل العينة ، بسبب عنصر تحكم مفقود. نظرا لتوافر مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة ، يمكن استهداف العديد من البروتينات المختلفة وعمليات الإشارات باستخدام هذه الطريقة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يعرض هذا المقال طريقة لالتقاط التغيرات الديناميكية في تنشيط البروتين في خلايا الدم الحمراء الغير نووية، مع معالجة التحديات في الحفاظ على هذه التغييرات للتحليل. يتيح البروتوكول التحقيقات الميكانيكية في إشارات الخلايا الحمراء الدموية من خلال التثبيت والكشف الفعال للتعديلات المؤقتة للبروتين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الميكانيكا الحيوية
- إشارات خلايا الدم الحمراء
- تعديلات البروتين
الخلفية
- التحقيق في تنشيط البروتين في خلايا الدم الحمراء أمر بالغ الأهمية لفهم الإشارات الميكانيكية.
- تلعب التعديلات المؤقتة للبروتين دورًا مهمًا في الاستجابات الخلوية.
- تواجه الطرق الحالية تحديات في الحفاظ على التغيرات الديناميكية أثناء التحليل.
- تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا موثوقًا لتثبيت البروتين وكشفه.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة لتثبيت التعديلات المؤقتة للبروتين في خلايا الدم الحمراء.
- لتمكين التحليل المكرر لتنشيط البروتين استجابة للمحفزات.
- لتعزيز البحث في التعديلات بعد الترجمة والإشارات الميكانيكية.
الطرق المستخدمة
- تخفيف الدم الكامل في فورمالديهايد 4% للتثبيت.
- الطرد المركزي لفصل المكونات الخلوية.
- تقنيات التلوين لكشف البروتين المحدد.
- استخدام أجسام مضادة محددة للتحليل.
النتائج الرئيسية
- الطريقة سهلة التطبيق وتنتج نتائج صالحة وقابلة للتكرار.
- فعالة في التقاط التعديلات المؤقتة للبروتين في خلايا الدم الحمراء.
- تسهيل التحقيقات في المجال الناشئ لإشارات الخلايا الحمراء الميكانيكية.
- تظهر مزايا على التقنيات الحالية في الحفاظ على التغيرات الديناميكية.
الخلاصات
- يعزز البروتوكول المقدم بشكل كبير دراسة ديناميات البروتين في خلايا الدم الحمراء.
- يفتح مسارات جديدة للبحث في الميكانيكا الحيوية والإشارات الخلوية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة للحصول على رؤى أعمق في وظيفة خلايا الدم الحمراء.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Immunostaining-based detection of dynamic red blood cell (RBC) protein alterations enables mechanistic interrogation of transient protein modifications critical for mechanobiology and post-translational signaling research. This capability supports early-stage target validation and de-risking in discovery pipelines where acute protein activation states inform therapeutic hypotheses. The method's reproducibility and semi-quantitative outputs facilitate robust portfolio triage and cross-program comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detection of acute protein activation states relevant to mechanotransduction and signaling pathways.
- Supports functional target validation by capturing transient post-translational modifications in RBCs.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific protein responses to experimental stimuli.
- Provides semi-quantitative data for hypothesis-driven portfolio advancement decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RBC samples for downstream screening of protein activation or inhibition.
- Standardizes antibody-based detection workflows for reproducible and comparable results.
- Enables quantitative image-based readouts suitable for assay development and optimization.
- Supports scalability through protocol adaptability to different antibody targets and detection modalities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by enabling detection of protein changes in response to physiological or pathological stimuli.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting biomarker identification in RBCs.
- Reduces translational risk by ensuring that observed protein modifications are robust and reproducible across conditions.
Pipeline & Workflow Integration
This immunostaining protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early mechanistic studies, assay development, and translational biomarker exploration in RBC systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting specific protein activation events.
- Screening: Delivers reproducible, semi-quantitative outputs for compound or condition evaluation.
- Analytics: Provides image-based gray value measurements and background correction for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by capturing disease- or treatment-relevant protein modifications.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to diverse antibody targets and mechanistic questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies by preserving transient protein states.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and detection for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by providing robust, semi-quantitative data on protein activation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying biological mechanisms and reducing late-stage uncertainty.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody selection, sample preparation, and microscopy-based imaging.
- Needs access to light and fluorescence microscopy, as well as image analysis software such as ImageJ or Fiji.
- Demands rigorous control staining to account for non-specific antibody binding and background signals.
- Adaptable to various RBC protein targets and signaling pathways with appropriate antibody validation.
- Limited to semi-quantitative analysis; absolute quantification may require complementary methods.
