تقييم علاج تعديل انقباض القلب في خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية 2D
ديسمبر 16, 2022
هنا ، نعرض طريقة تقييم انقباض الأجهزة الطبية القلبية غير الغازية باستخدام أحاديات الطبقة العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية 2D (hiPSC-CM) ، المطلية على ركيزة مرنة ، إلى جانب الفحص المجهري القائم على الفيديو. ستكون هذه الأداة مفيدة للتقييم في المختبر للخصائص المقلصة لأجهزة الفيزيولوجيا الكهربية للقلب.
يقوم مكتب مختبرات العلوم والهندسة في إدارة الغذاء والدواء بتطوير أدوات العلوم التنظيمية لمساعدة مطوري الأجهزة الطبية ومراجعي إدارة الغذاء والدواء. هدفنا النهائي هو تسريع وصول المرضى إلى الأجهزة الطبية المبتكرة والآمنة والفعالة من خلال أفضل العلوم المتاحة. في هذا البروتوكول ، نطبق أحدث تقنيات الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لتقييم الأجهزة الطبية المستخدمة لعلاج أمراض القلب التي تهدد الحياة.
تتيح هذه الأداة البسيطة إجراء تقييم قابل للتكرار لأجهزة الفيزيولوجيا الكهربية للقلب في الطبق باستخدام معدات المختبرات القياسية. يمكن استخدامه أيضا مع الخلايا الخاصة بالمريض المشتقة من المتبرعين المصابين بأمراض القلب المختلفة. للبدء ، قم بطلاء خلايا عضلة القلب البشرية المذابة iPSC المشتقة على 0.1٪ من ألواح الآبار المعقمة المغلفة بالجيلاتين قبل يومين على الأقل من بذر خلايا عضلة القلب على ركيزة الهيدروجيل المرنة.
استزراع الخلايا العضلية القلبية البشرية المستمدة من iPSC في وسط عضلة القلب القياسي لمدة يومين إلى أربعة أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح لهم بالتعافي من الحفظ بالتبريد. قم بتحديث الوسط المستهلك باستخدام وسط عضلة القلب بنسبة 100٪ كل 48 ساعة. تحقق من حالة الخلايا العضلية القلبية البشرية المشتقة من iPSC قبل التفكك من خلال تقييم صحة الخلايا ، وضمان الصلاحية والضرب المستقر.
اغسل خلايا عضلة القلب بأربعة ملليلتر لكل بئر من DPBS بدون كلوريد الكالسيوم أو كلوريد المغنيسيوم. أضف ملليلتر واحد من كاشف تفكك درجة حرارة الغرفة إلى كل بئر واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من وسط عضلة القلب إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر.
افصل الخلايا العضلية القلبية عن الألواح ذات الستة آبار باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر وأضف تعليق الخلية إلى الأنبوب المخروطي. شطف الآبار مع ملليلتر واحد من وسط عضلة القلب الطازجة لجمع أي خلايا عضلة القلب المتبقية وإضافتها إلى الأنبوب المخروطي. ثم أحضر الحجم النهائي للأنبوب المخروطي إلى 15 ملليلتر مع الوسيط.
جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 200 جرام لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية حتى علامة ملليلتر واحد. أعد تعليق الخلايا في وسط عضلة القلب إلى حجم نهائي يبلغ خمسة ملليلتر وعد الخلايا العضلية القلبية باستخدام عداد خلايا يدوي أو آلي. بعد ذلك ، احتضان تعليق خلية عضلة القلب لمدة 30 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة بينما يتم تحضير ركائز الهيدروجيل المرنة.
جهز ماصة سعة 20 ميكرولتر مثبتة في ميكرولتر واحد ، وأطراف ماصة ، ولوحة سفلية زجاجية معقمة من 48 بئرا ، ومؤقت ساعة توقيت في غطاء زراعة الأنسجة. امزج المصفوفة خارج الخلية أو ركيزة هيدروجيل القائمة على ECM عن طريق النقر برفق على الأنبوب ووضعه على الفور مرة أخرى على الجليد. ابدأ مؤقت ساعة الإيقاف مباشرة قبل طلاء ركيزة الهيدروجيل الأولى وحدد هذا على أنه الوقت صفر.
ماصة ميكرولتر واحد من ركيزة هيدروجيل لأعلى ولأسفل ثلاث مرات تقريبا لتبريد طرف الماصة. ثم ضع ما يقرب من ميكرولتر واحد من ركيزة الهيدروجيل غير المخففة أفقيا على قاع كل بئر في لوحة 48 بئرا ، مع الاحتفاظ بالماصة بزاوية 45 درجة. ضع جميع ركائز الهيدروجيل في نفس الاتجاه في كل بئر للمساعدة في تحديد الركيزة عند إجراء التجارب عند تكبير 40X.
ضع الغطاء على لوحة 48 بئرا واترك ركائز الهيدروجيل تحضن لمدة ثماني إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الأنسجة قبل إضافة الخلايا. بعد الحضانة ، قم على الفور بزرع خلايا عضلة القلب بالتنقيط مباشرة على ركائز هيدروجيل مع ما يقرب من 30،000 خلية عضلية قلبية قابلة للحياة لكل بئر في حجم متوسط منخفض يبلغ حوالي 200 ميكرولتر من وسط عضلة القلب. بعد إغلاق الغطاء ، اسمح لخلايا عضلة القلب بالاحتضان دون عائق لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الغطاء لتمكين الخلايا من الالتصاق بركيزة الهيدروجيل.
أضف بلطف 100 ميكرولتر من وسط عضلة القلب الطازج إلى كل بئر. ضع الغطاء المغلق على حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى أربعة أيام. قم بتشغيل المجهر وغرفة التحكم البيئي لتحقيق التوازن إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
قم بإزالة وسط عضلة القلب من اللوحة المكونة من 48 بئرا وشطف كل بئر برفق مرتين باستخدام 600 ميكرولتر من تعديل انقباض القلب أو وسيط فحص CCM. ثم أضف 300 ميكرولتر من وسط فحص CCM لكل بئر وضع لوحة 48 بئرا على المجهر في غرفة التحكم البيئي. أدخل الأقطاب الكهربائية وازن الخلايا لمدة خمس دقائق.
لتسجيل مقاطع فيديو الانكماش باستخدام الفحص المجهري المستند إلى الفيديو ، افتح برنامج تسجيل الفيديو واضبط معدل إطارات يبلغ 100 إطار في الثانية. ثم حدد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار بالقرب من مركز الطبقة الأحادية hiPSC-CM. ثم يحفز الحقل الخلايا بمولد نبض تجاري لتسريع أحاديات الطبقات العضلية القلبية 2D كهربائيا.
ضع الخلية العضلية القلبية عند عتبة 1.5 مرة عند هرتز واحد مع معلمات النبض الأساسية. على سبيل المثال ، نبضات سرعة الموجة المربعة أحادية الطور مع مدة نبضة تحفيز 2 مللي ثانية تبلغ خمسة فولت. سجل فيديو الانكماش الأساسي للسرعة فقط قبل CCM لمدة لا تقل عن خمس نبضات.
ثم قم بتحفيز الطبقة الأحادية للخلايا العضلية القلبية بإشارة كهربائية تجريبية تبلغ 30 مللي ثانية تأخير ، ونبضتان متماثلتان ثنائية الطور لمدة 5.14 مللي ثانية ، مع مدة إجمالية تبلغ 20.56 مللي ثانية ، وسعة طور 10 فولت ، وفاصل زمني بين الطور صفري. سجل فيديو الانكماش الناجم عن CCM لمدة لا تقل عن خمس نبضات. قم بإيقاف تشغيل إشارة CCM ، وقم بالتحفيز بنبض سرعة خط الأساس وسجل فيديو انكماش لفترة الاسترداد بعد CCM لمدة لا تقل عن خمس نبضات.
استخدم برنامج انكماش قياسي لتحليل مقاطع فيديو الانكماش تلقائيا وتحديد الخصائص الانقباضية الرئيسية مثل سعة الانكماش ، ومنحدر الانكماش ، ومنحدر الاسترخاء ، والوقت حتى الذروة ، والوقت حتى خط الأساس 90٪ ومدة الانكماش 50٪ تم تمييز الخصائص التعاقدية أحادية الطبقة لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC البشرية وتم تحديد المعلمات الرئيسية لانقباض عضلة القلب. أدى تطبيق معلمات تحفيز CCM القياسية إلى تحسين خصائص الانقباض في المختبر. تم تقييم آثار تعديل تركيزات الكالسيوم خارج الخلية على خصائص انقباض الإنسان مع وبدون تحفيز CCM.
لوحظ اعتماد خط الأساس المتوقع للكالسيوم للانكماش ، بالإضافة إلى زيادة مستحثة في حساسية الكالسيوم على مستوى الطبقة الأحادية للخلايا العضلية القلبية. بالإضافة إلى ذلك ، كشف الاستجواب الدوائي لمسار إشارات بيتا أندروجيني أن تأثيرات التقلص العضلي التي يسببها CCM كانت جزئيا بوساطة إشارات بيتا الأدرينالية. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع هذه الأداة لتشمل خلايا عضلة القلب الخاصة بالمريض ، بما في ذلك اعتلال عضلة القلب التوسعي لفهم تأثير CCM في سياق حالات المرض.
هنا ، نركز بشكل أساسي على تقييم خصائص انقباض الإنسان. ومع ذلك ، باستخدام هذه الأداة ، يمكن للمرء أيضا تقييم قراءات اقتران تقلص الإثارة القلبية الأخرى بما في ذلك إمكانات الفعل ومعالجة الكالسيوم. هذه هي أول أداة علمية تنظيمية تجمع بين الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات عن طريق التكنولوجيا مع تقييم أجهزة القلب.
تمهد هذه الطريقة البديلة الطريق لتقييم الأجهزة الطبية في طبق ولديها القدرة على تقليل الحاجة إلى اختبار المواد الحيوانية والبشرية.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة غير جراحية لتقييم انقباض القلب باستخدام طبقات أحادية من خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSC-CM). يعتمد هذا النهج على ركائز مرنة ومجهر قائم على الفيديو، مما يوفر أداة قيمة لتقييم الأجهزة الكهربائية القلبية في المختبر.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكهربائية القلبية
- تقنية الخلايا الجذعية
- تقييم الأجهزة الطبية
الخلفية
- يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) إلى خلايا عضلة القلب.
- تتطلب الحالات القلبية طرق تقييم فعالة للأجهزة الطبية.
- قد تفتقر الطرق الحالية إلى إمكانية إعادة الإنتاج وعدم التدخل.
- تهدف هذه الدراسة إلى سد هذه الثغرات باستخدام طبقات أحادية من hiPSC-CM.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة تقييم غير جراحية للأجهزة القلبية.
- استخدام طبقات أحادية من hiPSC-CM لتقييم الخصائص الانقباضية.
- تعزيز إمكانية إعادة إنتاج اختبار الأجهزة القلبية.
الطرق المستخدمة
- زراعة hiPSC-CMs على ركائز هيدروجيل مرنة.
- مجهر قائم على الفيديو لتسجيل مقاطع فيديو الانقباض.
- تحفيز المجال لخلايا عضلة القلب لتقييم الانقباض.
- تحليل خصائص الانقباض باستخدام برامج متخصصة.
النتائج الرئيسية
- زراعة وصيانة ناجحة للطبقات الأحادية من hiPSC-CM.
- تقييم قابل لإعادة الإنتاج للخصائص الانقباضية التي لوحظت.
- تثبت فائدة الطريقة لمختلف الأجهزة القلبية.
- إمكانية التطبيقات الخاصة بالمريض باستخدام الخلايا المتبرع بها.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة المطورة أداة موثوقة لتقييم الأجهزة القلبية.
- تدعم تقدم العلوم التنظيمية في الأجهزة الطبية.
- قد يسهل هذا النهج وصول المرضى بشكل أسرع إلى العلاجات المبتكرة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Quantitative evaluation of cardiac contractility modulation (CCM) in 2D hiPSC-derived cardiomyocytes enables predictive, human-relevant assessment of cardiac device effects at the earliest stages of device R&D. This platform supports mechanistic de-risking and target validation for cardiac electrophysiology devices, providing robust, reproducible data to inform portfolio advancement and regulatory submissions. The approach bridges discovery biology and translational device safety, reducing reliance on animal models and accelerating nonclinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cardiac device effects on human contractile function in vitro.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying contractile response to electrophysiological modulation.
- Facilitates functional target validation for device-induced cardiac modulation.
- Provides predictive confidence for downstream device optimization and triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible contractility assays using hiPSC-CM monolayers on flexible hydrogels.
- Enables multiplexed readouts of contraction, calcium handling, and electrophysiology in a 48-well format.
- Supports assay scalability and platform reuse for diverse cardiac device candidates.
- Generates quantitative outputs suitable for comparative device evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro contractility data with disease-relevant human cardiac models, including patient-specific hiPSC-CMs.
- Enables translational biomarker development by linking device signals to functional cardiac outcomes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for device safety and performance testing.
- Reduces reliance on animal and early human studies by providing robust nonclinical data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the cardiac device R&D continuum from early discovery through preclinical safety and performance assessment.
- Discovery Biology: Quantifies device-induced changes in contractility, clarifying mechanistic pathways and biological targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative contractility and calcium sensitivity data for device candidate comparison.
- Analytics: Outputs include contraction amplitude, kinetics, and calcium dependence, supporting statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Enables disease modeling and patient-specific testing for translational continuity.
- Enterprise Reuse: Platform is adaptable for multiple device types and disease models, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac device evaluation.
- Operational Value: Standardizes contractility assessment, enhances reproducibility, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by providing robust nonclinical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac device candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hiPSC-CM culture, electrophysiology, and video-based contractility analysis.
- Needs access to flexible hydrogel substrates, environmental control chambers, and high-speed video microscopy.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and analytical software.
- Adaptable to various disease models and patient-specific hiPSC-CMs for broader translational relevance.
- Dependent on robust cell health and reproducible monolayer formation for consistent outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:50
Seeding of Cryopreserved Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs)
1:25
Dissociation and Counting of the Pre-Plated hiPSC-CMs
2:49
Flexible Hydrogel Substrates Preparation
4:35
Contraction Recording and Analysis
6:52
Results: Evaluation of CCM in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
7:59
Conclusion
