تحديد الجينات المشاركة في تطور الثغور عن طريق تسجيل النمط الظاهري للبشرة

تقدم طريقتا تحليل النمط الظاهري المعروضتان هنا صورا عالية الجودة تكفي لإجراء تحليل النمط الظاهري الكمي ولإظهار استجابات النمط الظاهري لعلاج الببتيد بتفاصيل البشرة. وبالتالي ، يمكن استخدام هاتين الطريقتين لفهم أنماط خلايا البشرة وتطورها. هاتان الطريقتان هما تقنيتان سهلتان وموثوقتان نسبيا لأنهما لا تتطلبان أي مواد كيميائية سامة أو قطعة بشرة تستخدم على نطاق واسع لتحليل النمط الظاهري للبشرة.

ومع ذلك ، فإن التقنيات معقدة وتتطلب تدريبا متخصصا. للبدء ، حدد بعناية وقطع واحدة من النبتات من الشتلات الفردية التي تنمو بشكل موحد مع الشتلات الأخرى على اللوحة للحد من التباين. ضع كل فلقة في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على ملليلتر واحد من محلول التثبيت باستخدام ملقط واترك العينة في محلول التثبيت طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة محلول التثبيت وإضافة ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 70٪. اقلب الأنبوب عدة مرات واترك الأنبوب الذي يحتوي على العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا. كرر هذه الخطوة باستخدام ملليلتر واحد من 50٪ إيثانول ثم 20٪ إيثانول.

استبدل ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 20٪ بملليلتر واحد من الماء المقطر ، واقلب الأنبوب الذي يحتوي على عينات النبتة عدة مرات واتركه لمدة 30 دقيقة تقريبا. قم بإزالة كل الماء المقطر من الأنبوب وأضف على الفور حوالي 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ Toluidine Blue O أو TBO لمدة دقيقتين تقريبا. قم بإزالة محلول تلطيخ TBO جيدا قدر الإمكان ثم اغسل العينات على الفور عدة مرات بإضافة ملليلتر واحد من الماء المقطر الطازج.

في غطاء التدفق الصفحي ، قم بزرع 10 إلى 12 شتلة أرابيدوبسيس عمرها يوم واحد بعناية من كل من الصفيحتين المحضرتين في صفيحة من 24 بئرا تحتوي على 1.5 ملليلتر من نصف وسط سائل MS في كل بئر. أضف إما 50 مللي مولار tris HCL buffer وحده أو تركيزين مختلفين من الببتيد إلى كل بئر يحتوي على الشتلات المنبتة على نصف ألواح أجار MS. امزج الشتلات برفق مع المخزن المؤقت وحده أو محلول الببتيد باستخدام ماصة وأغلق اللوحة بشريط micropore.

احتضان لوحة الفحص تحت ظروف يوم طويل لمدة خمسة إلى سبعة أيام عند 22 درجة مئوية. نقل الشتلات من البئر على شريحة غطاء وتشريح النبتة من الشتلات. ضع الجانب المحوري من النبتة باستخدام ملقط وقطعه إلى قطع صغيرة.

خذ شريحة مجهر نظيفة أخرى وضع قطرة من محلول يوديد البروبيديوم عليها. ضع إحدى قطع النبتة الصغيرة في القطرة باستخدام الملقط وضع غطاء الغطاء برفق. ضع محلول يوديد البروبيديوم الإضافي على حافة غطاء الغطاء لإزالة أي فقاعات هواء تتشكل.

قم بتصوير الجانب المحوري من النبتة باستخدام مجهر متحد البؤر وقارن الصور مع الصور من الشتلات المزروعة في نصف وسط MS يحتوي على مخزن مؤقت فقط. تظهر هنا صور النبتة المحورية من شتلات عمرها 10 أيام لثلاثة أنماط وراثية من Arabidopsis ، والنوع البري ، وخط STOMAGEN الصامت ، ومتحولات epf1 epf2. هنا، يمثل خط STOMAGEN الصامت الأنماط الجينية ذات الأعداد المنخفضة من الثغور، وتمثل طفرات epf1 epf2 الأنماط الجينية التي تحتوي على أعداد كبيرة من الثغور.

تم استخدام صور البشرة التمثيلية للفلقات من شتلات عمرها 10 أيام من النوع البري ، tmm ، والخطوط المعدلة وراثيا التي تحمل بنية التعبير المفرط للتعبير المفرط للاستراديول epf2 أو epf1 للتحليل الكمي للنمط الظاهري للبشرة. يظهر في هذا الشكل الصور التمثيلية متحدة البؤر للبشرة من النوع البري والنبتة epf2 التي نمت لمدة ستة إلى سبعة أيام في محلول عازل وبشرة النبتة epf2 المزروعة بدفعتين مختلفتين من ببتيدات epf2. من خلال تنفيذ هذا الإجراء ، تأكد من قطع إحدى النبتات من شتلة فردية تنمو بالفعل بشكل موحد مع الشتلات الأخرى.

اختر أيضا شتلة لا تلمس وسائط MS للحد من التباين. نقطة أخرى يجب تذكرها هي ذلك لا تضع أكثر من خمسة فلقات في أنبوب طرد مركزي واحد صغير. أيضا ، حرك الأنبوب برفق لضمان التوزيع المتساوي لبقع TBO حول النبتات لتلطيخها جيدا.

بالنظر إلى وجود العديد من الببتيدات الهيكلية في محلول الببتيد ، فإن طريقة الفحص الحيوي هذه ستكون مفيدة جدا لتحديد أشكال الببتيد المطوية والنشطة بيولوجيا بشكل صحيح ووظائفها البيولوجية.