ثقافة الخنازير المعوية 3D العضوية من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد وإنشاء أحاديات الخلية

يوفر بروتوكولنا أدوات لدراسة ظهارة معوية الخنازير للبحوث البيطرية والطبية الحيوية. يمكن استخدام العضويات المعوية من الخنازير لدراسة نقل المغذيات ، ووظيفة الحاجز ، والتفاعلات بين المضيف والميكروب. من خلال الحفاظ على الخبايا الظهارية المعوية الخنازير تسمح بإنشاء مخزون كبير من الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها لاحقا لثقافة العضوية في 3D أو 2D أحادي الطبقات.

هذا البروتوكول مفصل للصائم ، ولكن يمكن استخدامه أيضا لقطاعات معوية أخرى مثل الاثني عشر والدقاق والقولون. للبدء ، قم بإذابة قارورة تحتوي على 900 سرداب مجمد بسرعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. انقل محلول القبو إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر.

أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة طاف. أضف 150 ميكرولترا من المصفوفة خارج الخلية أو ECM بطرف مبرد للحصول على تركيز نهائي قدره 150 سرداب لكل 25 ميكرولتر من ECM. ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات للحصول على تعليق متجانس من الخبايا في ECM.

قم ببذر ستة آبار بانخفاض 25 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة 48 بئرا تم تسخينها مسبقا. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لبلمرة ECM. أضف 250 ميكرولتر لكل بئر من الاستزراع المتوسط في درجة حرارة الغرفة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

قم بتغيير وسط الثقافة كل يومين إلى ثلاثة أيام. لتمرير المواد العضوية ثلاثية الأبعاد المشتقة من الخبايا المجمدة بعد 10 أيام من البذر ، قم بإزالة وسائط الاستزراع وإضافة 250 ميكرولتر من PBS المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، استبدل PBS ب 250 ميكرولتر من كاشف تفكك الإنزيم قبل التسخين المكمل بمثبط صخور 10 ميكرومولار عند 37 درجة مئوية في كل بئر.

افصل المواد العضوية في ECM عن طريق الكشط باستخدام ماصة P-1000 وتجانسها بعناية عن طريق سحب خمس مرات. احتضان لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل فصل الخلايا عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات. أضف 500 ميكرولتر من DMEMc في كل بئر يحتوي على خلايا منفصلة واسحب ما يصل إلى 12 بئرا في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من DMEMc البارد.

أجهزة الطرد المركزي عند 500 × ز لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد بارد DMEMc. عد الخلايا بتخفيف واحد إلى اثنين باللون الأزرق المثقب باستخدام عداد خلية.

أجهزة الطرد المركزي الحجم اللازم لمحلول الخلية للحصول على 3000 خلية حية لكل قبة. أعد تعليق الحبيبات ب 17 ميكرولترا من DMEMc البارد لكل 3000 خلية حية على الجليد. اضبط مستوى الصوت على العدد المطلوب من الآبار.

أضف ببطء 33 ميكرولترا من ECM البارد لكل 3000 خلية حية. اضبط مستوى الصوت على العدد المطلوب من الآبار وتجانسها دون عمل فقاعات. ثم انظر الآبار التي تحتوي على 50 ميكرولترا من تعليق خلية ECM لكل بئر في صفيحة 24 بئرا تم تسخينها مسبقا واحتضانها لمدة 30 دقيقة لبلمرة ECM.

أضف 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع لكل بئر. ثم احتضان وتغيير وسط الثقافة كل يومين إلى ثلاثة أيام. لطلاء ملحق الثقافة ، قم بإعداد محلول الطلاء الذي يحتوي على الكولاجين الوريدي المخفف عند 50 ميكروغرام لكل ملليلتر في برنامج تلفزيوني بارد.

أضف 150 ميكرولترا من محلول الطلاء المخفف إلى كل إدراج لثقافة الخلية واحتضانها طوال الليل أو لمدة ثلاث ساعات. بعد خمسة أيام من الانقسام ، افصل المواد العضوية باستخدام ECM عن طريق كشطها باستخدام ماصة P-1000. يتم تجانسها بعناية عن طريق السحب في وسط الاستزراع ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من DMEMc البارد على الجليد.

أجهزة الطرد المركزي المواد العضوية التي تم جمعها عند 500 × جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من كاشف تفكك الإنزيم الذي تم تسخينه مسبقا والمكمل بمثبط 10 ميكرومولار ROCK. ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات لبدء تفكك المواد العضوية.

احتضان لمدة خمس دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية للهضم الأنزيمي. قم بتعطيل المواد العضوية ميكانيكيا عن طريق سحب 10 مرات وإضافة أربعة ملليلتر من الثلج البارد DMEMc. أجهزة الطرد المركزي وتجاهل المادة الطافية قبل تعليق حبيبات الخلايا العضوية في ملليلتر واحد من DMEMc.

عد الخلايا باللون الأزرق المثقب باستخدام عداد الخلية واحسب الحجم اللازم للبذر 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل إدراج مزرعة. أجهزة الطرد المركزي الحجم اللازم لتعليق الخلية المقابلة ل 2.5 مرة 10 من الخلايا الخامسة لكل إدراج ثقافة. أثناء الطرد المركزي ، قم باستنشاق محلول الطلاء بعناية من إدخالات الثقافة واتركه يجف تحت الغطاء بدون غطاء لمدة خمس دقائق.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بالحجم اللازم من الوسط 2D المكمل بمثبط 10 ميكرومولار ROCK. بذر 200 ميكرولتر من تعليق الخلية على الغشاء القابل للنفاذ المطلي. أضف 500 ميكرولتر من الوسط 2D المكمل بمثبط 10 ميكرومولار ROCK إلى المقصورة السفلية واحتضانها.

يجب ملاحظة كثافة عالية من الخلايا على الغشاء. بعد يوم واحد من البذر ، استبدل الوسائط الملحمية والقاعدية بوسائط 2D جديدة بدون مثبط ROCK. قم بتغيير الوسائط كل يوم.

تصبح الطبقة الأحادية متقاربة بعد يوم واحد من البذر ويمكن استخدامها في تجاربها. في هذه الدراسة ، تم الحصول على الخبايا الظهارية من أمعاء الخنزير وحفظها بالتبريد للتخزين طويل الأجل في النيتروجين السائل. بعد ذوبان الجليد ، تم زرع الخلايا الجذعية القبو في ECM.

لوحظت الكائنات العضوية في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام ونمت بسرعة وطورت هياكل ناشئة. بعد حوالي 10 أيام من ذوبان الجليد ، تم إجراء مرور المواد العضوية لتوسيع الثقافة. من أجل الصيانة المثلى للثقافة ، يجب أن تقدم الكائنات العضوية المستخدمة في التعبئة تجويفا واضحا وفارغا وحواف محددة جيدا مع عدم وجود حطام أسود في التجويف كما لوحظ في الكائنات العضوية الناضجة.

تلتصق الخلايا وتشكل طبقة أحادية متقاربة بالكامل في غضون يوم واحد وهو ما تؤكده المقاومة الكهربائية العالية عبر الظهارة ، أو TEER ، التي تبلغ حوالي 700 قبة سنتيمتر مربع. يظل TEER مرتفعا لمدة ثلاثة أيام. يشير تلطيخ الأكتين إلى أن الجانب القمي للخلايا الظهارية موجه نحو التجويف في الكائنات العضوية 3D.

تشكل الخلايا العضوية المصنفة في حشوات المستنبتة طبقة مفردة متقاربة من الخلايا الظهارية مع توجيه الجانب القمي نحو الجزء العلوي. يكشف تلطيخ Occludin عن وجود تقاطعات ضيقة في الجانب القمي للخلايا الظهارية في المواد العضوية 3D وفي أحاديات الطبقة الخلوية. من المهم أن نتذكر أن العضو المستخدم في زرع أحاديات الخلايا يجب أن يبدو واضحا مع تجويف فارغ بدون حطام أسود يتوافق مع تراكم الخلايا الميتة.

يمكن استخدام الطبقات الأحادية من العضو العضوي المعوي للخنزير لاختبار تأثيرات المستقلبات أو الميكروبات على وظيفة الحاجز الظهاري باستخدام المقايسات الوظيفية والتصوير وتحليل التعبير الجيني.