تصوير أحادي الجزيء للحركة الجانبية ونشاط القناة الأيونية في طبقات الدهون المزدوجة باستخدام المجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF)

القنوات الأيونية ليست ثابتة في الأغشية البيولوجية. نقدم هنا نهجا بصريا لجزيء واحد لكشف العلاقة بين انتشار الغشاء الجانبي ووظيفة القناة الأيونية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى هي أن وضع العلامات الفلورية للبروتينات التي قد تتداخل مع حركتها الجانبية ووظيفتها غير مطلوب.

يمكن تطبيق الطريقة على أي قناة بروتين غشائية حيث يكون الانتشار الحر أو المقيد مهما للتنظيم والوظيفة. للبدء ، قم بنقل 380 ميكرولترا من محلول مخزون DPhPC إلى قنينة زجاجية ، وقم بتراكب محلول مخزون الدهون مع الأرجون أو غاز النيتروجين لمنع أكسدة الدهون. استخدم أقل تدفق ممكن للغاز لتجنب تبخر المذيب العضوي الذي تذوب فيه الدهون ، أو رش بخاخات المذيبات من القارورة.

جفف عينة الدهون تحت تيار من النيتروجين وقم بإزالة المذيب العضوي المتبقي من عينة الدهون تحت الفراغ باستخدام مضخة تفريغ خالية من الزيت طوال الليل. قم بإذابة طبقة الدهون في محلول زيت سيليكون سداسي الديكان عن طريق إضافة كميات متساوية من سداسي ديكان وزيت السيليكون باستخدام ماصة ملليلتر واحد إلى تركيز دهون نهائي قدره 9.5 ملليجرام لكل ملليلتر. ضع بعض أغطية الزجاج في حامل انزلاق من الفولاذ المقاوم للصدأ وقم بتنظيفها في دورق زجاجي لمدة 10 دقائق باستخدام الأسيتون في منظف بالموجات فوق الصوتية.

شطف أغطية بالماء منزوع الأيونات المزدوج وجففها تحت تيار من النيتروجين. علاوة على ذلك ، قم بتنظيف الغطاء وتحويله إلى منظف بلازما بالأكسجين لمدة خمس دقائق. قم بتركيب غطاء معالج بالبلازما على طبقة دوارة وقم بتغطية غطاء الغطاء بطبقة بسمك دون ميكرومتر من الأغاروز عن طريق إضافة 140 ميكرولترا ببطء من الأغاروز منخفض الانصهار بنسبة 0.75٪ مع ماصة 200 ميكرولتر عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.

قم بتوصيل الغطاء المطلي بالدوران على الفور بطبقة رقيقة من هيدروجيل الأغاروز إلى الجانب السفلي من غرفة PMMA. تأكد من أن هيدروجيل الأغاروز يشير إلى الأعلى. ثبت حواف غطاء الغطاء على جهاز PMMA الصغير بشريط لاصق شفاف ، وضع الجهاز على صفيحة ساخنة يتم تسخينها إلى 35 درجة مئوية.

صب بعناية 200 ميكرولتر من محلول الأغاروز 2.5 ٪ في مدخل الغرفة دون خلق فقاعات الهواء. قم على الفور بتغطية آبار غرفة PMMA بحوالي 60 ميكرولترا من محلول زيت الدهون لبدء تكوين طبقة أحادية الطبقة الدهنية عند واجهة زيت الأغاروز لتجنب جفاف الأغاروز المغلف بالدوران في آبار غرفة PMMA. ضع الجهاز على طبق ساخن عند 35 درجة مئوية لمدة ساعتين تقريبا.

ضع حوالي 20 ميكرولترا من محلول زيت السيليكون سداسي ديكان الدهني في كل من الآبار العديدة المصنعة في غرفة حضانة القطيرات. قم بإعداد إبرة زجاجية ذات شعيرات دقيقة بقطر فتحة طرف يبلغ حوالي 20 ميكرومتر باستخدام مجتذب ماصة دقيقة رأسي أو أفقي. املأ الإبرة بحوالي خمسة ميكرولترات من محلول الحقن المائي الذي يحتوي على 8.8 مللي مولار HEPES ، وسبعة ميكرومولار من صبغة الفلورسنت ، و Fluo-8 ، و 400 ميكرومولار EDTA ، و 1.32 كلوريد البوتاسيوم المولي و 30 مركب TOM الأساسي النانوي أو بدلا من ذلك 20 nanomolar OMPF.

قم بتركيب الإبرة بمحلول الحقن المائي على حاقن نانوي يحركه بيزو وقم بحقن 100 إلى 200 نانولتر من القطرات المائية في الآبار في غرفة حضانة القطيرات المملوءة بمحلول زيت السيليكون سداسي ديكاني الدهون باستخدام الحاقن النانوي. السماح بتكوين طبقة أحادية دهنية عند واجهة زيت القطيرات لمدة ساعتين تقريبا عن طريق الحفاظ على PMMA وغرف حضانة القطيرات على صفيحة ساخنة يتم تسخينها إلى 35 درجة مئوية. قم بنقل القطرات المائية الفردية يدويا من آبار غرفة حضانة القطيرات إلى آبار غرفة PMMA باستخدام ماصة ميكرولتر أحادية القناة مع طرف بولي بروبيلين يمكن التخلص منه سعة 10 ميكرولتر.

اسمح للقطرات بالغرق على الطبقات الأحادية الدهنية عند واجهات زيت الهيدروجيل لتشكيل طبقة ثنائية دهنية بين القطرات وهيدروجيل الأغاروز. قم بتركيب غرفة PMMA باستخدام أغشية ثنائية الطبقة أو DIB لواجهة القطيرات على حامل العينة لمجهر ضوئي مقلوب ، وقم بتقييم تكوين الغشاء باستخدام هدف تباين تعديل هوفمان 10x. إذا تشكلت أغشية DIB ، فقم بتركيب غرفة PMMA على حامل عينة مجهر TIRF المجهز بمصدر ضوء تقليدي لإضاءة التألق ، وليزر 488 نانومتر ، وكاميرا CCD مضرة بالإلكترون الخلفي لتحقيق حجم بكسل يبلغ حوالي 0.16 ميكرومتر.

ركز حافة غشاء DIB بهدف تكبير 10x تحت إضاءة التألق مع مصدر ضوء عالي الكثافة باستخدام مجموعة مرشح GFP. قم بالتركيز الدقيق على نفس حافة غشاء DIB عند التكبير العالي باستخدام هدف TIRF لزيت 100x NA 1.49 ، مرة أخرى تحت إضاءة التألق مع مصدر ضوء عالي الكثافة باستخدام مجموعة مرشح GFP. قم بتغيير إعداد المرشح من GFP إلى مجموعة مرشح TIRF رباعية النطاق ، وقم بتشغيل ليزر 488 نانومتر ، واضبط شدة الليزر على العدسة الموضوعية.

لتصور القنوات الأيونية المفردة ، اضبط زاوية TIRF وكسب كاميرا EM CCD بحيث تظهر القنوات الأيونية المفتوحة في غشاء DIB كبقع فلورية عالية التباين على خلفية داكنة ، وتصل نسبة الإشارة إلى الخلفية إلى الحد الأقصى. تأكد من أن البقع المقابلة لتدفق أيونات الكالسيوم من خلال قنوات الأيونات المفردة تظل في بؤرة التركيز ولها شكل دائري بكثافة عالية في المركز وتتناقص تدريجيا نحو المحيط. تأكد من أن البقع الفلورية في بؤرة التركيز للتأكد من أن القنوات الأيونية قد أعيد تشكيلها في أغشية DIB وتتحرك بشكل جانبي في مستوى الغشاء.

أخيرا ، سجل سلسلة من الصور الغشائية التي تسمح بالتتبع المناسب للموضع ومراقبة الحالة المفتوحة والمغلقة للقنوات الأيونية الفردية. لتحديد نوع الحركة الجانبية وحالة نشاط القناة ، احصل على مسارات طويلة بما فيه الكفاية وعينات جيدة. يظهر هنا هيكل Cryo EM ل Neurospora crassa TOM-CC.

تم إذابة الميتوكوندريا من صبغة N.crassa التي تحتوي على TOM 22 مع علامة 6-His في DDM وخضعت لكروماتوغرافيا تقارب النيكل NTA وكروماتوغرافيا تبادل الأنيون. يتم عرض SDS-PAGE للهيكل البلوري المعزول TOM-CC و SDS-PAGE من E.coli OMPF المنقى المستخدم للمقارنة هنا. يشير تتبع سعة الفلورسنت في المسار المقابل ل TOM-CC إلى أن نشاط القناة المفتوحة والمغلقة ل TOM-CC يرتبط بحركة الغشاء الجانبي للمجمع.

يعرض تتبع السعة ثلاث حالات نفاذية: حالة مفتوحة بالكامل تتوافق مع القنوات المتحركة وحالة النفاذية المتوسطة وحالة القناة المغلقة المقابلة للقنوات غير المتحركة. يتذبذب TOM-CC في الحالة المتوسطة حول موقعه المتوسط بحوالي زائد / ناقص 60 نانومتر. يظهر هنا تتبع سعة الفلورسنت في المسار المقابل ل OMPF.

يكشف OMPF عن مستوى شدة واحد فقط مقارنة ب TOM-CC ، بغض النظر عما إذا كان في حالة حركة أو محاصرا. يتم تمييز أجزاء المسار المقابلة للفترات الزمنية للجزيئات المحاصرة باللون الرمادي. أحد الأشياء المهمة التي يجب ملاحظتها هو أن هذه الطريقة تحلل بروتينات الغشاء الواحد في بيئة غشاء سليمة.

ستبقى ديناميكيات البروتينات الغشائية أفقا للدراسات العلمية في المستقبل المنظور. نتوقع أن تساهم طريقتنا في هذا المجال بشكل كبير.