مراقبة كعب 1 بوساطة Pexophagy
مايو 12, 2023
يوفر هذا البروتوكول تعليمات لتحفيز ومراقبة الكسوفاجي بوساطة Stub1 في الخلايا الحية.
تقوم البيروكسيسومات بأكسدة بيتا وهي عرضة لتلف أنواع الأكسجين التفاعلية. تسمح هذه الطريقة بالتحقيق في كيفية تعامل الخلايا مع البيروكسيسومات المجهدة ب ROS. لا يستخدم هذا البروتوكول فقط لاستهداف جميع البيروكسيسومات عالميا داخل مجموعة الخلايا ولكن يمكن أن يسمح أيضا بمعالجة البيروكسيسومات الفردية داخل الخلايا المفردة.
يمكن أيضا استخدام توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة لاستهداف العضيات خارج البيروكسيسومات لاستكشاف كيفية تعامل الخلايا مع إصابات العضيات. للبدء ، قم بزرع مرتين في 10 إلى خلايا SHSY5Y البشرية الخامسة أو ستة في 10 إلى خلايا NIH H3T3 للفأر الرابع في 840 ميكرولتر من وسط الاستزراع على أطباق استزراع ذات قاع زجاجي 35 ملم مع ميكروويل زجاجي قطره 20 ملم. تنمو الخلايا تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا بالبلازميدات المرغوبة باستخدام كاشف النقل أو نقل الخلايا SHSY5Y. تمييع البلازميدات في 55 ميكرولتر من DMEM / F-12 الخالي من المصل وتخفيف ميكرولتر واحد من كاشف النقل في 55 ميكرولتر من DMEM / F-12 الخالي من المصل. الجمع بين الحمض النووي المخفف مع الكاشف المخفف.
تخلط بلطف وتحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف المركب إلى البئر الصغير 20 ملم المطلي مسبقا ب 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الذي يحتوي على خلايا SHSY5Y بدون مضادات حيوية. هز الطبق برفق ذهابا وإيابا.
قم بإجراء نقل خلايا NIH 3T3 كما هو موضح من قبل ولكن استبدل وسط المصل المخفض بدلا من DMEM / F-12 الخالي من المصل لتخفيف البلازميد وكاشف النقل. بعد ساعتين من النقل ، قم بإزالة الوسط المحتوي على كاشف النقل وأضف ملليلتر واحد من وسط الاستزراع الطازج. احتضان خلايا NIH 3T3 أو SHSY5Y عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء ، في غضون 24 ساعة بعد النقل ، قم بإزالة وسط الاستزراع وإضافة 10 ميكرولتر من 200 نانومولار HaloTag TMR ligand أو 200 نانومولار Janelia Fluor 646 HaloTag ligand على البئر الصغير الزجاجي 20 ملم. انقل الطبق إلى حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون واتركه لمدة ساعة واحدة لتلطيخ الخلايا. بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة وسط التلوين جيدا وأضف ملليلتر واحد من وسط الثقافة الطازجة.
ضع طبقا ذو قاع زجاجي يحتوي على الخلايا المطلوبة على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مزود بحاضنة على سطح المسرح. في البرنامج ، انقر فوق نافذة الأداة ، واختر Optical ، وانقر فوق الزر DIA لتشغيل الضوء المرسل. اعرض الطبق من خلال عدسة المجهر واجعل الخلايا في بؤرة التركيز عن طريق تدوير مقبض التركيز.
اختر LSM وانقر على زر تحديد كاشف الصبغة. انقر نقرا مزدوجا فوق الأصباغ المطلوبة في النافذة المنبثقة لتحديد إعدادات الليزر والمرشح المناسبة لتصوير الخلايا. انقر فوق Live4x في اللوحة الحية لبدء المسح السريع بالليزر لبدء فحص إشارات الفلورسنت للخلايا.
حرك المرحلة باستخدام وحدة التحكم في عصا التحكم وحدد موقع الخلايا المتوسطة التي تعبر عن diKillerRed VKSKL أو SLP-VKSKL لتطبيق ضغط ROS على البيروكسيسومات. الحصول على صورة للخلية المطلوبة. انقر فوق نافذة الأداة واختر تحفيز LSM.
ثم انقر فوق الزر الناقص وفي نافذة Live Image ، استخدم الماوس لرسم عائد استثمار يبلغ قطره 15 ميكرومتر يحتوي على البيروكسيسومات المرغوبة التي سيتم تطبيق ضغط ROS عليها. لتطبيق إجهاد ROS ، استخدم 561 نانومتر للخلايا التي تحتوي على ليجند SLP المسمى diKillerRed VKSKL أو TMR واستخدم 640 نانومتر للخلايا الملطخة ب Janelia Fluor 646 المسمى SLP ligand. حدد الطول الموجي لليزر لتطبيق إجهاد ROS.
أدخل نسبة الليزر المطلوبة والمدة. لإنتاج ROS في البيروكسيسومات ، انقر فوق اكتساب ثم زر التحفيز لبدء المسح باستخدام 561 أو 640 نانومتر من الضوء من خلال عائد الاستثمار لمدة 30 ثانية لكل منهما. يتوافق هذا التحفيز مع ما يقرب من 5٪ من إعدادات طاقة الليزر ل 561 و 640 نانومتر.
بعد 30 ثانية من إضاءة الليزر ، تفقد البيروكسيسومات داخل عائد الاستثمار إشارات diKillerRed VKSKL أو TMR أو Janelia Fluor 646. يسمح فقدان الإشارة هذا بتمييز البيروكسيسومات المضيئة وغير المضيئة داخل الخلية. لمراقبة الخلايا الحية للفيح، اتبع نقل Stub1 أو Hsp70 أو يوبيكويتين أو p62 أو LC3B الموسومات الموسومة ب EGFP إلى البيروكسيسومات المضيئة أو المجهدة ب ROS عن طريق التصوير بفاصل زمني باستخدام فواصل زمنية مدتها 10 دقائق بين الإطارات.
تؤدي الإضاءة البؤرية إلى إنتاج ROS فوري وموضعي داخل البيروكسيسومات الفردية كما هو موضح من قبل مراسل الفلورسنت roGFP2-VKSKL. تم التقاط صورة diKillerRed VKSKL بعد إجراء جميع قياسات roGFP2-VKSKL للإشارة إلى موقع البيروكسيسومات التالفة. تظهر البيانات أيضا أن البيروكسيسومات غير المضيئة لا تتأثر ، مما يشير إلى دقة المنهجية.
تم استخدام هذه المنهجية لمراقبة pexophagy بوساطة Stub1. خلال هذه العملية ، يظهر Hsp70 و Stub1 والبروتينات المنتشرة في كل مكان ومحولات الالتهام الذاتي p62 و LC3B لاحقا في البيروكسيسومات المجهدة ب ROS لدفع pexophagy. باستخدام نفس الاستراتيجية ، كان من الممكن إتلاف جميع البيروكسيسومات في وقت واحد على طبق الاستزراع للتوصيف الكيميائي الحيوي ل pexophagy بوساطة Stub1.
قبل إضاءة LED ، كان مضان EGFP-ubiquitin متجانسا في السيتوبلازم ولم يتزامن مع البيروكسيسومات. بعد تسع ساعات من إضاءة LED ، تراكمت إشارات EGFP-ubiquitin على جميع البيروكسيسومات في الخلايا المزروعة في طبق متحد البؤر. باستخدام هذا البروتوكول ، وجدنا أن البيروكسيسومات المجهدة ب ROS تتم إزالتها من خلال مسار تحلل يعتمد على يوبيكوتين.
تقوم البيروكسيسومات المجهدة ب ROS بتجنيد يوبيكويتين E3 ligase Stub1 للسماح بإزالتها عن طريق pexophagy.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
المراجعة
تبحث هذه الدراسة في آلية pexophagy التي تتوسطها Stub1 استجابةً لـ peroxisomes التي تتعرض للإجهاد الناتج عن ROS في خلايا SHSY5Y البشرية الحية وخلايا NIH 3T3 الفأرية. تسلط المنهجية الضوء على نهج جديد لمراقبة pexophagy ودور مختلف البروتينات أثناء هذه العملية، مما يدل على أن peroxisomes التي تتعرض للإجهاد الناتج عن ROS يتم استهدافها للتحلل بطريقة تعتمد على اليوبيكويتين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- pexophagy
- استجابة الخلية للتوتر التأكسدي
- مسارات تحلل البروتينات
الخلفية
- الperoxisomes هي عضيات تشارك في العمليات الأيضية، بما في ذلك الأكسدة بيتا.
- يمكن أن تتضرر بسبب الأنواع التفاعلية للأكسجين (ROS)، مما يستلزم استجابات خلوية.
- Stub1 هي ليجيز E3 ubiquitin معروفة بمشاركتها في pexophagy.
الطرق المستخدمة
- تقنيات التصوير الحي بمجهري الفحص المجسم
- خلايا SHSY5Y البشرية وخلايا NIH 3T3 الفأرية كأنظمة نموذجية
- بروتوكولات التحويل والجيل المساعد بالصبغة لتكوين ROS
النتائج الرئيسية
- يؤدي توليد ROS الموضعي إلى تحديد peroxisomes المجهدة.
- يتم نقل Stub1 والبروتينات الأخرى مثل Hsp70 و p62 و LC3B إلى peroxisomes المجهدة الناتجة عن ROS.
- تم تأكيد مسارات التحلل المعتمدة على اليوبيكويتين في إزالة peroxisomes.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة منهجية جديدة لمراقبة pexophagy في الخلايا الحية.
- تكون النتائج هامة لفهم الاستجابات الخلوية للتوتر التأكسدي والتحكم في جودة العضيات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Stub1-mediated pexophagy monitoring enables precise interrogation of peroxisome quality control mechanisms in mammalian cells, directly informing early discovery and target validation for organelle turnover pathways. The ability to induce and track selective peroxisome degradation at both population and single-organelle levels supports predictive confidence in mechanistic de-risking and portfolio triage for oxidative stress-related targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic dissection of peroxisome turnover in response to ROS stress.
- Supports functional validation of Stub1 and associated autophagy modules as therapeutic targets.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing specific organelle responses to injury.
- Provides predictive confidence for advancing organelle quality control targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live-cell imaging assays for quantifying pexophagy events.
- Enables reproducible, quantitative measurement of protein translocation and ubiquitin accumulation.
- Supports assay standardization for screening modulators of peroxisome degradation.
- Permits scalable manipulation of peroxisomes for robust compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of oxidative stress and organelle dysfunction.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of autophagy pathways.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting peroxisome quality control.
- Provides translational biomarker opportunities via live-cell imaging readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology integrates from early discovery through lead identification, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analytics for organelle turnover mechanisms.
- Discovery Biology: Enables targeted ROS induction and mechanistic validation of pexophagy regulators.
- Screening: Provides reproducible, quantitative live-cell imaging outputs for assay development.
- Analytics: Delivers time-resolved measurements of protein recruitment and peroxisome degradation.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant oxidative stress models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for interrogating organelle quality control across cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in organelle turnover research.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and ROS induction protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for autophagy and quality control targets, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates modulating peroxisome degradation pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and confocal microscopy.
- Demands access to laser scanning confocal systems and dye-assisted ROS generation reagents.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification protocols.
- Adaptable to multiple mammalian cell models with appropriate transfection optimization.
- Precision of ROS induction must be validated to avoid off-target organelle effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:51
Preparation of Cells Expressing DiKillerRed or Self‐Labeling Proteins (SLPs) in the Peroxisome Lumen
2:52
Staining Peroxisomes with Dye‐Labeled SLP Ligands
3:39
ROS‐Stressing of Peroxisomes on a Laser‐Scanning Confocal Microscope
6:25
Results: Light‐Activated ROS Production and Stub1‐Mediated Pexophagy
7:50
Conclusion
