تجميع الجسيمات الشحمية بمساعدة الأوكتانول على الرقاقة للهندسة الحيوية

OLA هي منصة ميكروفلويديك متعددة الاستخدامات مفيدة لمجتمع البيولوجيا التركيبية. على وجه الخصوص ، للهندسة الحيوية للخلايا الاصطناعية. يمكن أن تساعدنا الجسيمات الشحمية القائمة على OLA في فهم مبادئ التنظيم الذاتي في علم الأحياء وبناء مجموعات تحاكي الخلايا.

تنتج OLA الجسيمات الشحمية أحادية التشتت ، unilaminar ، بحجم الخلية بطريقة عالية الإنتاجية وبكفاءة تغليف ممتازة. يتطلب أحجام عينات صغيرة جدا ، في حدود 50 ميكرولتر ، والجسيمات الشحمية المشكلة متاحة على الفور لمزيد من التجارب على الرقاقة. OLA مفيد لدراسة التفاعلات البيولوجية داخل microconfinements ، وديناميات الحويصلة ، والمكثفات الجزيئية الحيوية وتفاعلاتها مع الأغشية.

كما تم تطبيق OLA كمنصة عالية الإنتاجية لفحص المخدرات ، على سبيل المثال ، لاختبار نفاذية مضادات الميكروبات ونشاطها الغشائي. يعد تشغيل السطح ، وهو العلاج الكهروضوئي ، خطوة حاسمة للبروتوكول ويجب إجراؤه بعناية لمنع المحلول الكهروضوئي من دخول القنوات العضوية الداخلية والحاملة للدهون. أيضا ، يجب أن تكون قناة ما بعد الإنتاج طويلة بما يكفي لفصل جيوب الأوكتانول لتشكيل الجسيمات الشحمية.

كيتان جانار ، طالب دكتوراه من مختبري ، سيساعد تشانغ تشن في توضيح الإجراء. للبدء ، خذ رقاقة سيليكون نظيفة بقطر أربع بوصات وقم بتنظيفه بشكل أكبر باستخدام الهواء المضغوط لإزالة أي جزيئات غبار. قم بتركيب الرقاقة على طبقة دوارة وقم بتوزيع حوالي خمسة ملليلتر من مقاومة الضوء السلبية برفق في وسط الرقاقة.

للحصول على طبقة مقاومة للضوء بسمك 10 ميكرومتر ، اضبط إعدادات طبقة الدوران على 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع تسارع 100 RRP في الثانية للانتشار الأولي ، متبوعا بدوران مدته 60 ثانية عند 3000 دورة في الدقيقة مع تسارع 500 دورة في الدقيقة في الثانية. ثم قم بتدوير الرقاقة. تخبز الرقاقة على صفيحة تسخين لمدة دقيقتين عند 65 درجة مئوية ، ثم لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية.

بمجرد أن تبرد الرقاقة ، قم بتركيب الرقاقة في غرفة الطباعة الخاصة بآلة الطباعة الحجرية البصرية اليمنى المباشرة وقم بتغذية مجموعة الجسيمات الشحمية بمساعدة الأوكتانول أو تصميم OLA ، في البرنامج. بمجرد طباعة التصميم ، اخبز الرقاقة على حرارة 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، تليها 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. لغسل المقاومة الضوئية غير المعالجة ، اغمس الرقاقة في دورق زجاجي يحتوي على محلول المطور حتى تتم إزالة مقاومة الضوء غير المعالجة بالكامل.

اخبز الرقاقة بقوة على حرارة 150 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للتأكد من أن التصميم المطبوع متصل بإحكام بسطح الرقاقة ولا ينفجر في عملية التصنيع النهائية. لتحضير جهاز الموائع الدقيقة ، ضع الرقاقة الرئيسية على قطعة مربعة من الألومنيوم ولف رقائق الألومنيوم حول الرقاقة ، لتشكيل هيكل يشبه جيدا. صب برفق خليط PDMS على الرقاقة الرئيسية.

احتضان التجميع في فرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. أخرج الرقاقة الرئيسية من الفرن واتركها تبرد. لإزالة بوليديميثيل سيلوكسان المتصلب ، أو كتلة PDMS ، قم بإزالة رقائق الألومنيوم ثم انزع كتلة PDMS بعناية من حافة الرقاقة.

خذ زلة غطاء زجاجي شفاف ، واسكب ما يقرب من 0.5 مل من PDMS على وسط الشريحة الزجاجية ، وانشرها عبر شريحة الغطاء عن طريق إمالة الشريحة الزجاجية برفق ، مما يضمن التغطية الكاملة للشريحة الزجاجية باستخدام PDMS. قم بتركيب الشريحة الزجاجية على طلاء الدوران. تأكد من وضعه مركزيا بحيث يتداخل منتصف الشريحة مع مركز عمود الضغط.

ثم قم بتدوير الشريحة الزجاجية عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية بزيادة 100 دورة في الدقيقة في الثانية و 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية بزيادة 500 دورة في الدقيقة في الثانية. ضع الشريحة الزجاجية المطلية ب PDM بحيث يكون الجانب المطلي متجها لأعلى على منصة مرتفعة مثل كتلة من PDMS في طبق بتري مغطى. اخبزيها على حرارة 70 درجة مئوية لمدة ساعتين.

ضع كتلة PDMS بحيث تكون القنوات المحفورة متجهة لأعلى والشريحة الزجاجية المطلية ب PDMs مع توجيه الجانب المطلي لأعلى في غرفة التفريغ لمنظف البلازما. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية وتعريض المحتويات لبلازما الهواء بتردد راديو يبلغ 12 ميجاهرتز لمدة 15 ثانية لتنشيط الأسطح. يمكن رؤية بلازما الأكسجين في شكل لون وردي.

مباشرة بعد معالجة البلازما ، ضع الشريحة الزجاجية المطلية ب PDMS على سطح نظيف بحيث يكون جانب PDMS متجها لأعلى. ضع كتلة PDMS برفق مع توجيه نمط الموائع الدقيقة الآن نحو الشريحة الزجاجية المطلية ب PDMS ، مما يسمح لها بالترابط. اخبز الأجهزة المستعبدة على حرارة 70 درجة مئوية لمدة ساعتين.

قم بتوزيع 200 ميكرولتر من كحول البولي فينيل 5٪ ، أو محلول OVA ، في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر وقم بتوصيله بحامل خزان الموائع الدقيقة. أدخل الأنبوب بحيث يتم غمر أحد طرفيه في محلول PVA ويتم توصيل الطرف الآخر بمدخل القناة المائية الخارجية لجهاز الموائع الدقيقة. زيادة ضغط الطور المائي الخارجي إلى 100 مليبار لتدفق محلول PVA في القنوات المائية الخارجية.

زيادة ضغوط المراحل العضوية المائية الداخلية والحاملة للدهون إلى 120 مليبار لمنع التدفق العكسي لمحلول PVA داخل هذه القنوات. قم بتدفق محلول PVA بهذه الطريقة لمدة خمس دقائق تقريبا ، مما يضمن التشغيل الكامل لقناة الخروج. قم بزيادة الضغط في القنوات المائية العضوية والداخلية الحاملة للدهون إلى قضيبين لإزالة محلول PVA ، وافصل الأنبوب على الفور عن المدخل المائي الخارجي.

في الوقت نفسه ، استخدم أنبوبا متصلا بقناة ضغط سلبي لإزالة PVA الزائد من قناة الخروج. اخبز الجهاز على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة واتركه يبرد قبل الاستخدام. يمكن تخزين الجهاز في ظل الظروف المحيطة لمدة شهر على الأقل.

قم بتوزيع المحاليل في ثلاثة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر وقم بتجميعها. قم بتوصيلها برقاقة الموائع الدقيقة المعالجة ب PVA وتطبيق ضغط إيجابي على القنوات الثلاث ، حوالي 100 مليبار على القنوات العضوية المائية الداخلية والحاملة للدهون وحوالي 200 مليبار على القناة المائية الخارجية. بمجرد أن تبدأ المراحل الثلاث في التدفق المشترك عند التقاطع ، تأكد من بدء إنتاج المستحلب المزدوج وضبط الضغط وفقا لجودته.

مع تدفق قطرات المستحلب المزدوجة ، تصبح جميع جيوب الأوكتانول أكثر بروزا وأخيرا يتم قرصها ، وتشكل الجسيمات الشحمية. تظهر هنا صورة مجال ساطع للتوليد السريع لقطرات المستحلب المزدوج. تظهر قناة الدهون الفلورية تكوين أوكتانول كل الجيب بسبب إزالة الرطوبة الجزئية.

تظهر القناة المائية الداخلية تغليف البروتين الفلوري الأصفر. يظهر في هذا الشكل إزالة الرطوبة من جيب الأوكتانول في قناة الخروج التي تشكل الجسيمات الشحمية. تمثل هذه الصورة مخططا للانتقال المعتمد على الأس الهيدروجيني للمحلول المتجانس للبولي ليسين والأدينوسين ATP المغلف داخل الجسيمات الشحمية إلى بولي ليسين ATP المفصول الطور.

البيئة الحمضية الأولية في الجسيمات الشحمية تجعل الشحنة الجزيئية ل ATP محايدة ، مما يثبط التآكل. عندما يتوازن الرقم الهيدروجيني داخل الجسيمات الشحمية مع زيادة الأس الهيدروجيني المطبقة خارجيا ، يكتسب ATP شحنة سالبة ، مما يؤدي إلى التدخل. يوضح هذا الشكل التوزيع المكاني للبوليسين والغشاء وصور الفاصل الزمني لتكوين بوليسين ATP داخل الجسيمات الشحمية.

يرفع الإصدار الخارجي من المخزن المؤقت الأساسي مستوى الأس الهيدروجيني داخل الجسيمات الشحمية على مدار دقائق ويبدأ التدخل. T يساوي صفر دقيقة يشير إلى الوقت قبل حدوث حدث التصارع الأول. أثناء عرض الإجراء ، من الضروري ضبط ضغط القناة بصبر من أجل توليد إنتاج مستحلب مزدوج ثابت.

تم استخدام OLA وتنوعاته في دراسات متنوعة ، على سبيل المثال ، نمو وتقسيم الجسيمات الشحمية لفهم ديناميكيات المكثفات الجزيئية الحيوية ، والتعبير الخالي من الخلايا للبروتين ، وكذلك تغليف البكتيريا. لذلك في كدمة ، نعتقد أن OLA هي منصة متعددة الاستخدامات للبيولوجيا التركيبية.