يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يصف هذا البروتوكول عزل النظام الضوئي الأول (PSI) - مركب حصاد الضوء الأول (LHCI) عن الأنسجة النباتية. PSI جنبا إلى جنب مع PSII مسؤول عن تحويل الضوء إلى طاقة كيميائية في الأكسجين الضوئي وله كفاءة كمية ~ 1 ، مما يجعله هدفا لدراسة نقل الطاقة المدفوعة بالضوء.
تستخدم هذه الطريقة لعزل النظام الضوئي الأول (PSI) مع مجمع حصاد الضوء I (LHCI) ، هوائي أصله ، من النباتات. PSI-LHCI عبارة عن مركب بروتين غشائي كبير ينسق مئات عوامل حصاد الضوء ونقل الإلكترون وهو أكثر أنظمة حصاد الضوء كفاءة الموجودة في الطبيعة. يتم نقل الفوتونات التي تمتصها بروتينات هوائي LHCA الأربعة التي تشكل LHCI من خلال التفاعل المثير إلى مركز التفاعل الأساسي PSI وتستخدم لتسهيل فصل الشحنات التي تحركها الضوء عبر غشاء الثايلاكويد ، مما يوفر طاقة وطاقة مخفضة لتثبيت الكربون في الكائنات الحية ذاتية التغذية الضوئية. تجعل الكفاءة الكمومية العالية ل PSI هذا المجمع نموذجا ممتازا لدراسة نقل الطاقة المدفوعة بالضوء. في هذا البروتوكول ، يتم تجانس الأنسجة النباتية ميكانيكيا ، ويتم فصل البلاستيدات الخضراء عن الحطام الخلوي السائب عن طريق الترشيح والطرد المركزي. ثم يتم تحلل البلاستيدات الخضراء المعزولة بشكل تناضحي ، ويتم استعادة أغشية الثايلاكويد عن طريق الطرد المركزي وقابلة للذوبان باستخدام المنظف n-dodecyl-beta-maltoside. يتم تحميل المادة القابلة للذوبان على عمود تبادل الأنيون لجمع معظم المجمعات المحتوية على الكلوروفيل. يتم ترسيب المجمعات الأكبر من المحلول ، وإعادة تعليقها في حجم صغير ، وتحميلها على تدرجات السكروز لفصل المجمعات الرئيسية المحتوية على الكلوروفيل. تتميز كسور تدرج السكروز الناتجة لتحديد النطاق ذي الأهمية الذي يحتوي على PSI-LHCI. يشبه هذا البروتوكول إلى حد كبير البروتوكول المستخدم في بلورة PSI-LHCI النباتي مع بعض التبسيطات ويعتمد على الأساليب التي تم تطويرها على مر السنين في مختبر ناثان نيلسون.
يعد التمثيل الضوئي الأكسجيني أحد أهم التفاعلات الكيميائية على كوكبنا. يحدث تحويل الضوء إلى طاقة كيميائية في مراكز التفاعل لنظامين ضوئيين ، النظام الضوئي الأول (PSI) والنظام الضوئي الثاني (PSII) 1 (الشكل 1 أ). PSI هو مركب كبير متعدد الوحدات الفرعية والبروتين الصبغي الذي تطور منذ أكثر من 3.5 مليار سنة2،3. يسهل هذا المركب ، الذي يحتوي على ما يقرب من 100 جزيء من الكلوروفيل وحوالي 20 كاروتينات ، نقل الإلكترونات عبر غشاء الثايلاكويد من البلاستيوسيانين إلى الفيريدوكسين الذي يعمل كمتقبل للإلكترون النهائي لسلسلة نقل الإلكترون الضوئية1،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. تحضير أغشية الثايلاكويد من أوراق السبانخ
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يستخدم هذا البروتوكول لعزل وتوصيف PSI-LHCI النشط من الأنسجة النباتية على مدار ثلاثة أيام. يتم تنقية PSI-LHCI عن طريق عزل أغشية الثايلاكويد النباتية أولا والتي يتم إذابتها بعد ذلك باستخدام β-DDM. الغلة النموذجية من مرحلة تحضير الغشاء هي 200 مجم من الكلوروفيل من 500 غرام من الأوراق. يمكن أن يختلف هذا بناء على المواد الأولية المستخدمة.
يستخدم اليومان الثاني والثالث من التجربة كروماتوغرافيا تبادل الأنيون والطرد المركزي المتدرج للسكروز لفصل مجمعات البروتين المختلفة داخل غشاء الثايلاكويد. بعد الذوبا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تنقية مركب PSI-LHCI من الأنسجة النباتية في حالته النشطة. تم استخدام أوراق السبانخ هنا ، ولكن يمكن تطبيق هذه الطرق على الاستعدادات من نباتات مختلفة23،40. في جميع الحالات ، يجب توخي الحذر أثناء تنفيذ هذا البروتوكول لحماية المجمع من التلف. يجب أن يتم هذا التحضير في الظلام أو تحت الضوء الأخضر ، على الجليد مع مخازن مبردة مسبقا ، ويجب تنفيذ جميع خطوات إعادة التعليق برفق.
أثناء .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
يقر Y.M. بالدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب الجائزة رقم 2034021 ووزارة الطاقة الأمريكية ، ومكتب العلوم ، ومكتب علوم الطاقة الأساسية ، وقسم العلوم الكيميائية ، وعلوم الأرض ، والعلوم البيولوجية بموجب الجائزة رقم. DE-SC0022956. CG مدعومة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب الجائزة رقم 00036806.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 15 مل أنبوب فالكون | VWR | 62406-200 | يستخدم لتخزين الثايلاكويدات |
| Bio rad Econo-Column 1.5 × 30 سم | biorad | 7374153 | |
| القماش القطني الصف 50 ، 100٪ قطن | Arkwright LLC | B07D1FZZMB | من قضبان زجاج |
| أمازون Millipore Sigma | BR135825 | أي قضيب مماثل يكفي | |
| خلاط فيتاميكس 64 أوقية | فيتاميكس | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| أنابيب الطرد المركزي المفتوحة من البولي ألومر | سيتون ساينتفيك | 5030 | |
| أوبتيما XE الطرد المركزي الفائق | بيكمان كولتر | A94471 | |
| البولي إيثيلين جلايكول 6,000 | هامبتون ريسيرش | HR2-533 | |
| مطحنة الأنسجة بوتر إلفيهجين ، 30 مل. | WHEATON | 358049 | |
| السكروز | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| SW 40 Ti | beckman coulter | 331301 | |
| TOYOPEARL DEAE-650C | Tosoh Bioscience | 7988 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| & beta ;-DDM | Glycon - Biochemicals GmbH | D97002 | مخزنة كمخزون بنسبة 10٪ عند -20 درجة ؛ ج |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً