إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر

باستخدام عضويات الغدة الدمعية، يمكن النظر في كيفية تحكم جينات معينة في توازن الغدة الدمعية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام المواد العضوية للطب التجديدي. الميزة الرئيسية لتقنية الغدة الدمعية العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة هي أنها تسمح بنمو ودراسة الخلايا الظهارية للغدة الدمعية السليمة وغير المحولة.

يمكن استخدام هذه المواد العضوية في نهاية المطاف لعلاج المرضى الذين يعانون من مرض جفاف العين. ابدأ بإعداد الوسط والمواد المطلوبة للتجربة ، متبوعا بدمج جميع مكونات وسط الهضم قبل التجربة. بلل المشارط مسبقا في هذه الوسيلة لتجنب التصاق قطع الأنسجة بها.

استرجع أنسجة الغدة الدمعية للفأر من الوسط ، وضعها في طبق بتري ، وفرمها باستخدام مشارط مبللة مسبقا. بمجرد أن تصبح قطع الأنسجة أقل من 0.5 ملليمتر مكعب ، اكشطها من طبق بتري بالمشرط ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على وسط الهضم. للحصول على خزعة بشرية صغيرة جدا ، ضعها مباشرة في وسط الهضم دون فرم.

احتضن الأنبوب الذي يبلغ سعته 15 ملليلترا والذي يحتوي على قطع مناديل لمدة تصل إلى 15 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. في غضون ذلك ، قم بتضييق طرف ماصة باستور في اللهب ، وقم بترطيبه مسبقا في الوسط الأساسي. لتسهيل عملية التفكك ، ماصة المزيج المفروم لأعلى ولأسفل كل خمس دقائق باستخدام ماصة باستور الضيقة والمبللة مسبقا.

عندما تكون العديد من الخلايا المفردة والكتل الصغيرة مرئية تحت المجهر ، أوقف التفكك بإضافة 10 ملليلتر من الوسط الأساسي. بعد الدوران لأسفل عند 400 جرام لمدة خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من الوسط الأساسي لتكرار الغسيل والحبيبات أسفل الخلايا. قم بإزالة قطع الأنسجة الكبيرة غير المهضومة وألياف الكولاجين المتبقية عن طريق تصفية الخليط المفروم من خلال مصفاة 70 ميكرومتر.

أدر الشطف على 400 جرام لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من المصفوفة الباردة خارج الخلية ، أو ECM ، للغدة الدمعية لفأر واحد و 50 ميكرولترا من ECM البارد لخزعة بشرية ، دون إنشاء الفقاعات. قم بزرع ما يصل إلى 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر من لوحة تعليق ذات 12 بئرا باستخدام P200 لعمل قطرات 20 ميكرولتر تقريبا في البئر.

ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة للسماح بتصلب ECM. بمجرد ترسيخ ECM ، أضف ما يقرب من ملليلتر واحد من وسط تمدد الماوس بدرجة حرارة الغرفة لكل بئر من لوحة 12 بئرا. تحضير ملليلتر واحد من وسط التمايز البشري الذي يحتوي على مكونات فردية تحفز إفراز عضويات الغدة الدمعية.

في مجهر برايت فيلد الآلي بفاصل زمني ، قم بإعداد المواضع المراد تصويرها في اللوحة ، والفاصل الزمني لمدة خمس دقائق ، ومدة أربع ساعات. تأكد من أن قطرة ECM كاملة مرئية في كل موضع. قبل البدء في التصوير ، قم بإزالة وسط الاستزراع من الآبار المراد تصويره دون تحريك اللوحة من المجهر ، واستبدله بوسط تمايز بشري معد حديثا ومعاد تعليقه جيدا يحتوي على مركبات ، بما في ذلك فورسكولين ونورادرينالين.

كعنصر تحكم سلبي ، قم بتضمين بئر مع وسيط تمايز محدث. انقر فوق زر التشغيل على المجهر ، وقم بتحليل النتائج بعد أربع ساعات. بعد فصل المواد العضوية كما هو مذكور في النص ، تخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي. في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر، قم بإعداد البلازميدات اللازمة للتجربة. أضف البلازميدات إلى الخلايا ، واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.

قم بإعداد جهاز الحفر الكهربائي باستخدام معلمات نبض المسام ونقل النبض. ضع الخلايا مع البلازميدات في كوفيت التثقيب الكهربائي. قم بقياس المقاومة على الفور ، والتي يجب أن تكون بين 0.3 أمبير و 0.55 أمبير ، وقم بالكهرباء على الفور.

بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي المكمل بمثبط Rho-kinase. اترك الخلايا تتعافى في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتقطيع الخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق.

بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بطلاء الخلايا في 200 ميكرولتر من ECM. بعد التصلب ، أضف وسيط توسيع الماوس. لإعداد عضوي ، قم بتقسيم عضويات الغدة الدمعية البشرية قبل ثلاثة أيام تقريبا من يوم الزرع.

لاستخراج المواد العضوية من ECM ، أضف dispase إلى وسط الاستزراع للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.125 وحدة لكل ملليلتر ، وأعد تعليق قطرات ECM تماما لتعطيلها باستخدام P1000. ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق المواد العضوية في 10 ملليلتر من الوسط الأساسي لغسل الإنزيم.

بعد تكوير الخلايا عند 400 جرام لمدة خمس دقائق ، أعد تعليقها في 50 ميكرولترا من وسط التمدد البشري البارد المكمل ب 5٪ ECM. ضع التعليق العضوي على الجليد ، وانتقل فورا إلى عملية الزرع. لزراعة تقويم العظام في الفئران ، نضح تعليق عضوي في إبرة الأنسولين.

عندما يكون الماوس نائما ، ضعه بسرعة على جانبه مع إمكانية الوصول إلى الغدة الدمعية الرئيسية. حقن خمسة ميكرولتر من التعليق العضوي مباشرة من خلال الجلد في الغدة الدمعية. اسمح للفأر بالتعافي ، وقم بتقييم وجود أي إزعاج متعلق بالزرع يوميا ، خاصة في العين.

بعد تشريح الغدة الدمعية للفأر ، ولد الهضم الأنزيمي والميكانيكي شظايا الأنسجة الصغيرة ، بما في ذلك العنيبات والقنوات. في الاشتقاق العضوي الناجح للغدة الدمعية للفأر ، تم العثور على عضويات كيسية يبلغ قطرها حوالي 500 ميكرومتر بعد سبعة أيام. نمت عضويات الغدة الدمعية البشرية كأكياس في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام ووصلت إلى حجم كامل النمو في غضون 10 إلى 14 يوما بعد عزل الأنسجة.

بعد خمسة أيام وسبعة أيام ، على التوالي ، في وسط التمايز ، أصبحت عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية أكثر كثافة. أدى تطبيق منشط AMP الدوري فورسكولين أو الناقل العصبي بافراز إلى تورم عضوي في أقل من ثلاث ساعات. في التثقيب الكهربائي الناجح ، نمت المواد العضوية المقاومة للهيجروميسين.

تم اختيار الحيوانات المستنسخة العضوية المتنامية التي يزيد حجمها عن 300 ميكرومتر قبل تمايزها. أسفر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لموضع Pax6 المستهدف بواسطة الحمض النووي الريبي الموجه عن نطاق زوج أساسي 367 لجميع الحيوانات المستنسخة المختارة. تم الحصول على نسخة واحدة من الغدة الدمعية للفأر الضربة القاضية متماثلة الزيجوت من أصل ستة متسلسلة باستخدام الحمض النووي الريبي الموجه الذي يستهدف Pax6.

نمت بعض الحيوانات المستنسخة بشكل جيد ، لكن بعض الحيوانات المستنسخة العضوية فقدت بعد قطفها أو بدأت في التمايز. من بين 10 مستنسخات عضوية تم اختيارها ، نمت سبعة بشكل جيد. تم تأكيد النقش العضوي بعد شهر واحد من حقن المواد العضوية في الغدة الدمعية للفأر عن طريق تلطيخ علامة خاصة بالإنسان ، المستضد النووي البشري.

شيء واحد يجب الانتباه إليه هو عدم الإفراط في هضم الأنسجة ، ولا المواد العضوية. خلاف ذلك ، قد تموت الخلايا ، وهذا من شأنه أن يقلل من معدل تكوين العضوية. يمكن تحليل عضويات الغدة الدمعية عن طريق الأنسجة.

من خلال القيام بذلك ، يمكن للمرء الحصول على نظرة ثاقبة في تكوينها الخلوي.