تصور العضيات في الموقع عن طريق التصوير المقطعي بالتبريد STEM

يستخدم التصوير المقطعي TEM على نطاق واسع لتصوير الخلايا ، لكنه محدود للغاية من حيث سمك العينة. يمكن استخدام FIB SEM والتصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة لعينات أكبر ، وإن كان ذلك بدقة أقل. التصوير المقطعي STEM يملأ هذه الفجوة تماما.

يوفر التصوير المقطعي STEM نظرة على عينات سميكة ميكرون بدقة بضعة نانومترات. يتيح لنا الجمع بين التحضير المبرد إلقاء نظرة على العينات والأقسام البيولوجية في 3D. راجع أساسيات بصريات STEM لفهم تكوين الصورة والتأكد من أن مهندس الخدمة قد قام بمحاذاة أوضاع جذع STEM و Lomax جيدا ، وأن خطوات المعايرة تبدو مثل تلك الموجودة في الفيديو.

للبدء ، قم بتحميل ملف محاذاة العمود وافتح قيم العمود. إذا كنت تستخدم حامل تبريد للدخول الجانبي ، فافتح درع التبريد وابدأ في وضع TEM. يجب أن يظهر الشعاع على الشاشة.

اخفض التكبير إذا لم يظهر الشعاع. أحضر المجهر إلى التركيز المركزي عن طريق الضغط على الزر الموجود على لوحة التحكم. اضبط حجم البقعة على قيمة مناسبة لتصور شاشة الفلورسنت مباشرة ، أو باستخدام الكاميرا المدمجة.

اضبط المجهر على وضع STEM وتحقق من أن التركيز البؤري يستخدم عدسات المكثف بدلا من الهدف. على اللوحة ، اضبط التركيز المركزي واخرج من وضع الحيود لإجراء التعديلات الأولية. تأكد من أن الحزمة ليست فارغة وقم بتقليل التكبير حتى يظهر الشعاع على الشاشة.

اضبط إزاحة الحزمة إلى المركز وقم بزيادة التكبير بخطوات تصل إلى 70،000 ، مع الحفاظ على الحزمة في المركز. ثم أدخل فتحة المكثف المطلوبة ، عادة 50 ميكرومتر لوضع المسبار الصغير ، وتحقق من توسيط الفتحة. أثناء تدوير مقبض التركيز ذهابا وإيابا ، يجب أن تتمدد البقعة وتتقلص ، لكنها تظل في مكانها ، كما لو أن الطائرة تقطع ساعة رملية عمودية وهمية.

إذا لم تكن فتحة العدسة في المنتصف ، فستتحول الإضاءة بشكل جانبي كما لو كانت الساعة الرملية مائلة. قم بإحضار الشعاع إلى التركيز البؤري ، أو اضغط على تركيز قائمة الكثافة في علامة تبويب المحاذاة ، أو عد إلى التركيز البؤري المركزي. أعد ضبط موضع الشعاع على المركز واضبط مركز الدوران.

الآن ، أدر عجلة خطوة التركيز إلى الحد الأدنى ، أو خطوة واحدة أعلاه ، بحيث ينبض الشعاع بلطف وتأكد من بقائه ثابتا أثناء تحرك التركيز لأعلى ولأسفل. حدد النقاط المحورية واجمع النقطتين معا مع تعديلات X و Y. اضبط وصمات المكثف لجعل الحزمة مستديرة.

اذهب لأعلى ولأسفل من خلال التركيز للتحسين. يجب ألا يكون هناك ميل للاستطالة في اتجاه واحد أو آخر عند المرور عبر التركيز. قم بتطبيع العدسات ، ثم قم بزيادة التكبير تدريجيا إلى حوالي 240،000 ، أثناء استخدام إزاحة الحزمة للحفاظ على توسيط البقعة وتكرار مركز الدوران وتعديلات النقطة المحورية.

العودة إلى وضع الحيود. في هذه المرحلة ، يجب أن يظهر الشعاع كقرص موحد على شاشة الفلورسنت. يتحكم طول الكاميرا الآن بشكل فعال في المسافة البصرية إلى الكاشف كعلم بلورات بالأشعة السينية.

قم بتغييره وشاهد القرص ينقبض ويكبر كما لو أن موقع الشاشة سيتحرك نحو العينة أو بعيدا عنها. يمثل هذا المخروط إضاءة برايتفيلد. لتشغيل وضع STEM عند التكبير العالي ، ابدأ بكاشف جذع برايت فيلد واضبط محاذاة الحيود لتوسيط الحزمة باستخدام طول الكاميرا المطلوب.

قم بتشغيل علامة brightfield على الشاشة ، وقلل طول الكاميرا إلى 330 ، وارفع الشاشة وأدخل أجهزة الكشف. ابدأ الفحص في برنامج المجهر. استخدم عرض النطاق للمساعدة أثناء ضبط إعدادات السطوع والتباين كما هو موضح في المخطوطة.

كرر التعديل عدة مرات. أعد المجهر إلى تكبير منخفض نسبيا في سجل التكبير العالي ، دون الدخول في وضع التكبير المنخفض. أدخل شاشة الفلورسنت ولاحظ تيار الشاشة كمرجع.

كما هو الحال في TEM ، يمكن تغيير التيار باستخدام عدسة البندقية وإعدادات حجم البقعة بأعداد متزايدة تتوافق مع التيار المنخفض. في هذه المرحلة ، احفظ سجل FEG لتسهيل العودة إلى القيم القياسية. انتقل إلى وضع LMTEM لرؤية العينة.

أدخل العينة. أحضر العينة إلى ارتفاع مركزي. هناك عدة طرق للقيام بذلك.

على سبيل المثال ، استخدم تذبذب المسرح لإمالة الشبكة أثناء تحريك ارتفاع العينة على طول المحور Z حتى تتوقف الصورة عن التحول الجانبي. بدلا من ذلك ، حدد بعض الميزات على شاشة العرض وقم بإمالة المسرح إلى 10 إلى 30 درجة. ستتحرك الميزة بشكل جانبي.

اضبط ارتفاع العينة لإعادتها إلى موضعها الأصلي. قم بزيادة التكبير أو إمالة المسرح لتحسين الإمالة وإعادتها إلى درجة الصفر. عد الآن إلى وضع STEM وأدخل كاشف STEM.

تأكد من عدم تحديد تمكين فحص LM. انتقل إلى وضع التكبير العالي الأدنى. ضبط الاستجماتيزم المكثف بالطريقة.

باستخدام الحزمة فوق منطقة عينة رفيعة ، ركز على النقطة التي تنفجر فيها الحزمة المرسلة بين صور الظل للعينة على كلا الجانبين. ثم اضبط ضبط المكثف لجعل القرص المركزي دائريا. هذا يتطلب بعض الممارسة ، خاصة بالنسبة للعينات المبردة.

ارجع إلى فتحة 50 ميكرومتر وقم بتحديث سجل FEG. انتقل إلى وضع LMSTEM واستمر في المسح للعثور على منطقة مثيرة للاهتمام. إذا لزم الأمر ، أعد ضبط إعدادات سطوع الكاشف والتباين تقريبا في هذه المرحلة.

اضغط على التركيز المركزي ، وقم بزيادة التكبير وتحسين التركيز أثناء المسح باستخدام حلقة التركيز التي يوفرها المجهر وتحقق من الاستجماتيزم على حبات الذهب. حتى الآن ، يتم تنفيذ كل شيء في وضع مسبار النانو. لاحظ أن إدخال فتحة مكثف أصغر يقلل من زاوية التقارب شبه ، وهو أمر مفيد للعينات السميكة.

نهج بديل مع أدوات TFS هو التبديل إلى وضع المسبار الصغير ، مما يؤدي إلى تقليل زاوية شبه التقارب. بعد ذلك ، اضبط طول الكاميرا من أجل الحصول على زاوية تجميع أكبر بثلاث مرات من زاوية التقارب ؛ أي أن علامات منطقة كاشف BF على الشاشة أكبر بثلاث مرات من الحزمة.

قدر جرعة التسجيل باستخدام معادلة. كقاعدة عامة ، استهدف من 100 إلى 150 إلكترونا لكل محبر مربع للتصوير المقطعي بأكمله. أعد المرحلة إلى الكل واضبط تيار الشعاع باستخدام حجم البقعة و / أو إعدادات عدسة البندقية للوصول إلى تيار الشاشة المطلوب.

تظهر خريطة شبكة التكبير المنخفض الكاملة المسجلة في وضع STEM المناطق ذات الخلايا ذات الأهمية. تظهر الخلايا ساطعة جزئيا مع إلكترونات متناثرة باتجاه كاشف HAADF. عرضت خريطة متوسطة الدقة مسجلة في وضع STEM خريطتي مرساة متوسطة الدقة.

سمح ميل درجة الصفر لسلسلة إمالة الساق بتصور رواسب فوسفات الكالسيوم وعلامات cristae والذهب الائتمانية للميتوكندريون. يتم عرض حجم تجسيد 60 نانومتر وأقسام بسمك 40 نانومتر. يوفر التصوير المقطعي الجذعي بالتبريد ، أو CSTET ، جسرا بين البيولوجيا الهيكلية وبيولوجيا الخلية ، بالإضافة إلى سياق مضان فائق الدقة.

دون الحاجة إلى التقسيم أو إعداد الصفيحة ، يمكننا أن نرى المسرح الخلوي بأكمله في حالة أصلية قريبة.