القياس الكمي وتوصيف الجينوم الكامل للحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 في عينات مياه الصرف الصحي والهواء

يستخدم علم الأوبئة القائم على مياه الصرف الصحي حاليا لاستكمال استراتيجيات مكافحة COVID-19 في جميع أنحاء العالم من خلال الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي في عينات مياه الصرف الصحي وتحديد حالات التفشي المحتملة. توفر هذه التقنية لمحة على مستوى السكان عن انتشار COVID-19 في مجتمعنا ، والذي يتضمن الحالات التي لا تظهر عليها أعراض. أخذ عينات الهواء هو أيضا إضافة مهمة لهذا البروتوكول.

لا يزال التشخيص السريري هو الطريقة الأكثر دقة لإدارة تفشي الأمراض والأوبئة. ومع ذلك ، لا تزال هذه التقنية مفيدة كمكمل لها. تحتوي هذه الطريقة على العديد من الخطوات والنقاط الحرجة.

يعد العرض المرئي ضروريا ، لأنه سيسمح للمختبرات التي ليست على دراية بالبيولوجيا الجزيئية بتكرار الإجراء. للبدء ، اجمع لترا واحدا من عينة مياه الصرف الصحي المركبة على مدار 24 ساعة. ارتفاع 20 ميكرولتر من فيروس mengovirus إلى 70 ملليلتر من العينة.

بعد الطرد المركزي للعينة عند 700 جرام لمدة 10 دقائق ، ركز المادة الطافية الناتجة باستخدام جهاز الترشيح الفائق بالطرد المركزي مع قطع 10 كيلو دالتون عن طريق الطرد المركزي. تخلص من التركيز عن طريق الطرد المركزي عند 700 جرام لمدة 40 دقيقة ، وعكس موضع جهاز الترشيح الفائق. استخدم التركيز الناتج لاستخراج الحمض النووي الريبي.

لجمع عينات الهواء ، ضع مخروطا معقما في جهاز أخذ عينات الهواء قبل بدء التجميع. بمجرد انتهاء أخذ العينات ، استخرج الحمض النووي الريبي من برنامج تلفزيوني مغسول للمخروط باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي التجارية أو طريقة داخلية. قم بإعداد المزيج الرئيسي للتفاعل لكل هدف ، فيروس mengovirus ، SARS-CoV-2 ، N1 و N2 في غطاء نظيف في غرفة إعداد الكاشف.

امزج مزيج البادئات والمسبار والإنزيم عن طريق قلب خمس مرات أو دوامة النبض. حفظ أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في رف بارد ، وتوزيع 15 ميكرولتر من المزيج في أنابيب PCR الشريط أو لوحة PCR 96 بئرا وضعت على رف التبريد. قم بتغطية اللوحة ونقلها إلى منطقة معالجة الحمض النووي.

دوامة بلطف حصصة من الحمض النووي الريبي المستخرج لمدة خمس ثوان. ماصة خمسة ميكرولتر من الحمض النووي الريبي إلى مزيج التفاعل لصنع 25 ميكرولتر وبدء RT-qPCR. في لوحة PCR ، ماصة 16 ميكرولتر من كل عينة إلى موضعها على اللوحة ، وإضافة أربعة ميكرولتر من النسخ العكسي خمس مرات أو مزيج RT الرئيسي.

ثم ابدأ تفاعل PCR. بعد ذلك ، قم بإعداد 10 تخفيفات ميكرومولية لكل مجموعة أولية والمزيج الرئيسي لكل مجموعة من البادئات. في لوحة PCR جديدة ، ماصة 20 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ، ثم خمسة ميكرولتر من عينة RT لكل مزيج.

بعد تغطية اللوحة ، ابدأ تفاعل PCR. بمجرد انتهاء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتدوير اللوحة لأسفل عند 1000 جرام لمدة 15 إلى 30 ثانية. لتنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف 50 ميكرولترا من الكاشف القائم على الخرز إلى كل بئر واخلطه عن طريق السحب لمتابعة الفصل المغناطيسي.

قم بإزالة اللوحة من الحامل المغناطيسي. أعد تعليق كل حبيبة ب 15 ميكرولترا من ماء درجة PCR واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ضع اللوحة مرة أخرى على الحامل المغناطيسي واترك الخرزات تلتيت لمدة دقيقتين.

ثم ماصة بعناية 15 ميكرولتر من طاف من كل عينة إلى لوحة PCR جديدة. بعد ذلك، لإعداد المكتبة، أضف 1.75 ميكرولترا من مخزن التفاعل من مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي (DNA) و0.75 ميكرولترا من مزيج الإنزيمات إلى كل عينة. دوامة لفترة وجيزة لوحة مغطاة وتدور لأسفل في 1000G لمدة 15 إلى 30 ثانية.

احتضان لمدة خمس دقائق عند 21 درجة مئوية وخمس دقائق عند 65 درجة مئوية. ماصة ثلاثة ميكرولتر من الماء الصف PCR لكل عينة إلى لوحة PCR جديدة. أضف 0.75 ميكرولتر من العينات المعدة و 1.25 ميكرولتر من الباركود لإعداد تسلسل المكتبة.

ثم أضف خمسة ميكرولترات من المزيج الرئيسي T4 DNA ligase واخلطه جيدا عن طريق الماصة. بعد الدوران أسفل اللوحة في جهاز الطرد المركزي ، احتضان اللوحة عند 21 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، وعند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تجميع جميع العينات ، أضف 192 ميكرولترا من الكاشف القائم على الخرز إلى المسبح لتنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل.

تخلط جيدا عن طريق ماصة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي. انتظر حتى يتم مسح المادة الطافية وتشكيل حبيبات الخرز.

قم بإزالة المادة الطافية والأنبوب من الحامل المغناطيسي. أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للجزء القصير أو SFB واخلطه عن طريق الماصة. ضع الأنبوب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي وانتظر حتى تتشكل الحبيبات ويزيل السائل.

تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة. أضف 35 ميكرولترا من ماء درجة PCR إلى الأنبوب ، واخلطه عن طريق السحب واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي واترك الخرزات تلتلى والسائل لتطهير.

ماصة 35 ميكرولتر من طاف إلى أنبوب جديد. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج تفاعل ربط المحول كما هو موضح في مخطوطة النص ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. امزج 20 ميكرولترا من الكاشف القائم على الخرزة مع مزيج تفاعل الربط لتنقية PCR ، واحتضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي وانتظر حتى تتشكل حبيبات الخرزة وتصبح المادة الطافية عديمة اللون. تخلص بعناية من المادة الطافية عن طريق الماصة. امزج 125 ميكرولترا من SFB في الأنبوب وضعه مرة أخرى على الحامل المغناطيسي لفصل الخرز.

عندما يصبح السائل صافيا ، تخلص من المادة الطافية وكرر إضافة SFB كما هو موضح سابقا. اترك الأنبوب على الحامل المغناطيسي مفتوحا لمدة 30 ثانية. أضف 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف واخلطه جيدا عن طريق الماصة.

بعد الدوران لفترة وجيزة والحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، ضعها على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقتين. ماصة 15 ميكرولتر من المادة الطافية في أنبوب ربط منخفض جديد لقياس التركيز باستخدام مجموعة قياس كمية الحمض النووي الفلورومترية. بعد ذلك ، أدخل خلية التدفق في جهاز تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي في الوقت الفعلي.

أدخل طرف ماصة 1،000 ميكرولتر مضبوطة على 200 ميكرولتر في منفذ التحضير. أدر عجلة ضبط مستوى الصوت لزيادة مستوى الصوت حتى رؤية السائل في الطرف ، ثم تجاهل الطرف. أضف 800 ميكرولتر من مزيج التحضير إلى منفذ التحضير بدون فقاعات وانتظر خمس دقائق.

ماصة 200 ميكرولتر من المكتبة مزيج في منفذ فتيلة. أغلق منفذ الغطاء ومنفذ التحضير. ابدأ تجربة التسلسل في البرنامج وحدد Base Calling On.اكتشفت هذه الطريقة وحددت كمية SARS-CoV-2 RNA في عينات مياه الصرف الصحي والهواء.

كان لعينات مياه الصرف الصحي انحراف معياري من 1.91٪ إلى 13.98٪ بين الثلاثيات ، وتراوحت من 3.05 في 10 إلى ثلاثة إلى 2.83 في 10 إلى ثماني نسخ جينية لكل لتر. تراوحت عينات الهواء من 6.17 في 10 إلى ثلاثة إلى 5.48 في 10 إلى تسعة ، مع الانحراف المعياري في التكرارات بين 0.54٪ و 10.95٪ كما هو موضح في هذا البروتوكول ، تم تسلسل العينات ، ويتم تلخيص مثال لثلاث نتائج عينة متسلسلة هنا. في جميع العينات الثلاث ، النسب BA.5.

تم تعيين x باعتباره الأكثر انتشارا بواسطة أداة Freyja. يعد تركيز عينات مياه الصرف الصحي خطوة حاسمة حيث يوجد الحمض النووي الريبي الفيروسي بتركيزات منخفضة في مياه الصرف الصحي. ولذا فإن هذه الخطوة أساسية للكشف الدقيق والقياس الكمي.

يمكن تكييف هذا الإجراء باستخدام مواد أولية مختلفة في بروتوكول RT-qPCR لاستخدامها للكشف عن العوامل المعدية الأخرى وقياسها. حددت هذه التقنية بدقة كمية SARS-CoV-2 في عينات مياه الصرف الصحي والهواء. يمكن الكشف عن مسببات الأمراض المختلفة وقياسها كميا من مواقع مختلفة.