رسم الخرائط البصرية مزدوجة الصبغة للقلوب من الفئران RyR2R2474S من عدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولاميني

ستساعدنا هذه الطريقة في الكشف عن الخصائص الفيزيولوجية الكهربية وآليات مسحات توقف البطين المرتبطة بأمراض مثل عدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولاميني. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا الحصول على إمكانات الغشاء وإشارات الكالسيوم بين الخلايا في وقت واحد بموجب بروتوكولات السرعة الكهربائية المبرمجة المختلفة ، وهي مناسبة بشكل خاص لاستكشاف الآليات الأساسية وديناميكيات أمراض عدم انتظام ضربات القلب مثل CPVT. لإجراء هذه التجربة بنجاح ، تأكد من أن لديك قلبا جيد النفاذية ، وتحميل الصبغة المناسب ، وفصل الإثارة والانكماش ، وإعدادات الكاميرا الدقيقة.

للبدء ، قم بإعداد نظام الخرائط الضوئية وتشغيل الكاميرا للحصول على درجة حرارة أخذ عينات ثابتة عند 50 درجة مئوية تحت الصفر. ضع قلب الفأر المحصود في محلول الكريب البارد لإبطاء عملية التمثيل الغذائي وحماية القلب. إزالة الأنسجة المحيطة من الشريان الأورطي.

استخدم إبرة قنية مصنوعة خصيصا لقنية ، وقم بإصلاحها بخياطة حريرية 4-0. الآن قم بتغذية القلب بنظام Langendorff بسرعة ثابتة من 3.5 إلى 4.0 ملليلتر في الدقيقة. أدخل أنبوبا بلاستيكيا صغيرا في البطين الأيسر لتحرير احتقان المحلول في الحجرة لتجنب التحميل الزائد وتثبيت الأنبوب البلاستيكي في إبرة التعليب.

ثم ضع اثنين من الخيوط في perfusate في الحمام وقم بتشغيل قوى صندوق مكبر للصوت الكهربائي ووحدة تحكم التحفيز الكهربائي. بعد ذلك ، ابدأ برنامج مخطط كهربية القلب أو ECG المشار إليه وراقب تخطيط القلب باستمرار. نفذ الخطوات اللاحقة في الظلام عندما يصل القلب إلى حالة مستقرة.

قم بثني خليط محلول بليبستاتين كريب باستمرار في القلب لمدة 10 دقائق لفصل الانقباض عن الإثارة وتجنب القطع الأثرية للانكماش أثناء التصوير. ثم باستخدام مصباح يدوي أحمر ، افحص القلب لتأكيد التوقف التام للانقباضات. قم بتغذية القلب بمحلول عمل Rhod-2 AM لمدة 15 دقيقة في نظام التروية Langendorff بعد فصل تقلص الإثارة.

الحفاظ على إمدادات الأكسجين أثناء تحميل صبغة الكالسيوم داخل الخلايا. لمنع تكوين الفقاعات من F-127 pluronic ، أدخل مصيدة فقاعات في نظام التروية. تمييع 10 ميكرولتر من محلول الأسهم RH 237 في 50 ملليلتر من perfusate وتحميل لمدة 10 دقائق.

عند الانتهاء من تحميل الصبغة المزدوجة ، التقط سلسلة من الصور. تأكد من أن إشارات الجهد والكالسيوم كافية للتحليل. قم بتشغيل مصباحي LED لأضواء الإثارة واضبط شدتهما على نطاق مناسب.

ضع القلب تحت جهاز الكشف ، وتأكد من أنه مضاء جيدا بواسطة مصباحي LED يضبطان قطر بقعة الضوء على سنتيمترين. اضبط مسافة العمل بين العدسة والقلب على 10 سم لتحقيق معدل أخذ العينات المطلوب والدقة المكانية. افتح برنامج أخذ عينات الإشارة للتحكم في الكاميرا في نفس الوقت والتقاط إشارات الجهد والكالسيوم.

ابدأ تشغيل محفز مجال MyoPacer واضبط نمط السرعة على منطق ترانزستور الترانزستور مع ملي ثانية من مدة السرعة لكل نبضة. اضبط الكثافة الأولية على 0.3 فولت. ضع زوجا من الأقطاب الكهربائية البلاتينية المتصلة بخط النخاب في قمة البطين الأيسر.

قم بتطبيق 30 محفزا متتاليا 10 هرتز S1 لاختبار عتبة الجهد الانبساطي للقلب باستخدام برنامج تسجيل ECG. قم بزيادة سعة الجهد تدريجيا حتى يتم تحقيق التقاط واحد لواحد. تنفيذ بروتوكول S1-S1 لقياس الكالسيوم أو بدائل جهد الفعل وخصائص الاسترداد.

قم بتسريع وتيرة القلب على التوالي بدءا من طول دورة أساسي يبلغ 100 مللي ثانية. قلل طول الدورة بمقدار 10 مللي ثانية في كل تسلسل لاحق حتى تصل إلى 50 مللي ثانية. بدء رسم الخرائط البصرية في وقت واحد قبل التحفيز.

لقياس فترة الانكسار الفعال للبطين باستخدام بروتوكول التحفيز S1-S2 ، ابدأ بطول دورة سرعة S1-S1 يبلغ 100 مللي ثانية. الزوجان S2 عند 60 مللي ثانية وينخفض مع انخفاض خطوة 2 مللي ثانية حتى يفشل S2 في التقاط مجمع QRS خارج الرحم. لتحريض عدم انتظام ضربات القلب، يتم تطبيق سرعة الاندفاع الدائمة 50 هرتز وإجراء نفس حلقة السرعة بعد الانتظار لمدة ثانيتين من الراحة.

راقب بعناية تسجيلات مخطط كهربية القلب خلال فترة سرعة التردد العالي المستمرة لبدء تسجيلات الخرائط البصرية المتزامنة على الفور عند إنشاء موجة عدم انتظام ضربات القلب مثيرة للاهتمام. تابع التقاط الصور باستخدام كاميرا الجهاز المقترنة بمضاعفة شحنة الإلكترون. في برنامج الحصول على الصور ، اضغط على تحديد مجلد ، وقم بتحميل الصور لبدء عملية تحليل بيانات الفيديو الضخمة شبه التلقائية.

أدخل معلمات أخذ العينات الصحيحة للتحليل. اضبط عتبة الصورة يدويا وحدد منطقة الاهتمام. قم بتطبيق مرشح مكاني غاوسي ثلاثي البكسل ، ومرشح Savitzky-Golay ، وتصحيح خط الأساس للقبعة العلوية.

ثم اضغط على معالجة الصور لإزالة خط الأساس وحساب المعلمات الفيزيولوجية الكهربية مثل APD-80 و CATD-50. اضبط وقت بدء مدة جهد الإجراء عند الذروة والنقطة الطرفية عند إعادة استقطاب 80٪ لحساب APD-80. وبالمثل ، حدد وقت بدء مدة الكالسيوم العابرة على أنها الذروة مع كون النقطة النهائية 80٪ استرخاء.

يتم عرض آثار نموذجية في الخرائط الحرارية ل APD-80 و CATD-80. يقصر الأيزوبروتيرينول APD-80 والنوع البري وعدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولاميني أو الفئران CPVT ، ولكن لم يتم العثور على فرق بعد تحدي الأيزوبروتيرينول. كانت الفئران CATD-80 و CPVT أطول من النوع البري بعد تحدي الأيزوبروتيرينول بينما لم تكن هناك أهمية قبل العلاج.

وفقا لإشارات الجهد ، يمتلك النوع البري وقلوب CPVT نفس قدرة التوصيل عبر النخاب عند خط الأساس وبعد تدخل الأيزوبروتيرينول. أظهرت الخرائط الحرارية أن الفئران CPVT لديها نفس قدرة التوصيل مثل الفئران البرية قبل وبعد تحدي الأيزوبروتيرينول. أظهر تحليل بدائل سعة الكالسيوم أن إشارات الكالسيوم في القلوب البرية ظلت مستقرة عند خط الأساس خلال سرعة S1-S1 المتتالية عند 14.29 و 16.67 هرتز ، بينما أظهرت قلوب CPVT بدائل تعتمد على التردد.

بعد تحدي الأيزوبروتيرينول ، أظهرت قلوب CPVT بدائل تعتمد على التردد وإشارة الكالسيوم أثناء سرعة S1-S1 ، بينما لم تتأثر القلوب من النوع البري. اقترح تحليل عدم انتظام ضربات القلب Tachy أن كلا من النوع البري وقلوب CPVT تظهر توصيلا طبيعيا خلال سرعة انفجار 50 هرتز عند خط الأساس. بعد الإفراط في تناول الأيزوبروتيرينول ، أظهرت قلوب CPVT دوارات عالية التردد بعد سرعة انفجار 50 هرتز ، بينما حافظت القلوب من النوع البري على التوصيل الطبيعي.

بعد هذا الإجراء ، يتم استخدام أنواع الأدوجين والفئران البرية لتوضيح الخصائص الفسيولوجية والوظيفية الكهربائية في هذه النماذج أو في اختراع المستحضرات الصيدلانية. يعد رسم الخرائط الضوئية أداة قوية لدراسة عدم انتظام ضربات القلب ، ومع ذلك لا يمكن استخدامه سريريا بسبب محدودية صبغة الفلورسنت تحت فصل تقلص الإثارة. مع تطور الفلورسنت المناسب للجزيء المستهدف المختلف في ظل تطوير تقنية حساب الثورة العالية ، فإن تقنية رسم الخرائط البصرية للقلب لا بد أن تحقق التطبيقات فقط.