إنتاج الخلايا العصبية البشرية Neurogenin 2-inducible في مفاعل حيوي معلق ثلاثي الأبعاد

يتيح استخدام المفاعلات الحيوية لترجمة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو بروتوكولات زراعة IPSC من 2D إلى 3D توليد الخلايا بأعداد كبيرة للتطبيقات واسعة النطاق مثل الفحوصات عالية الإنتاجية. يعمل بروتوكول التمايز العصبي السريع هذا في بيئة 3D الفسيولوجية على تحسين تفاعلات الخلايا البادئة ويعطي إنتاجية عالية للخلايا على مدى فترة أقصر مع اختلاف منخفض من دفعة إلى = دفعة وبالتالي تقليل التكلفة والوقت. يطبق البنك الأوروبي للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات مناهج مماثلة للتوليد السريع والفعال من حيث التكلفة للخلايا المتمايزة عبر سلالات متعددة ، بما في ذلك خلايا الدماغ الأخرى وخلايا عضلة القلب.

ابدأ مرحلة ما قبل الزراعة عندما تكون الخلية الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، أو ثقافة iPSC البشرية ، متقاربة بنسبة 60 إلى 80٪. نضح الوسط تماما من iPSCs البشرية وشطف الخلايا برفق باستخدام 1X DPBS مرتين. أضف ملليلتر من محلول EDTA التربسين المسخن مسبقا إلى طبق بتري الذي يبلغ طوله ستة سنتيمترات واحتضان الخلايا لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة.

ثم اضغط برفق على الأطباق لتسهيل انفصال الخلايا أو احتضانها لمدة دقيقة إلى دقيقتين أطول إذا لم تنفصل الخلايا. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في كل طبق عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من وسيط صيانة IPSC الخالي من وحدة التغذية مع مثبط ROCK. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر أو 50 ملليلتر واخلطه برفق عن طريق السحب لضمان تفرد الخلية.

حدد أعداد الخلايا في 100 ميكرولتر من تعليق الخلية باستخدام عداد خلية آلي ونقل الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر من وسيط صيانة IPSC الخالي من وحدة التغذية مع مثبط ROCK.

املأ كل أنبوب سعة 50 ملليلترا ب 18 ملليلترا من الوسط. ثم قم بتوزيع 20 ملليلتر من تعليق الخلية في كل أنبوب مفاعل حيوي. ضع الأنابيب في نظام المفاعل الحيوي واضبط معلمات الزراعة لمدة غير محدودة.

ابدأ برنامج ما قبل الزراعة عبر شاشة المفاعل الحيوي. لتغيير الوسائط في اليوم التالي ، اترك الركام يستقر في أنابيب المفاعل الحيوي لمدة خمس دقائق تقريبا قبل استنشاق المادة الطافية بعناية. أضف 15 ملليلترا من وسط صيانة IPSC الطازج الخالي من التغذية بدون مثبط ROCK لكل أنبوب واستمر في الزراعة في المفاعل الحيوي الموضوعة على الطاولة لمدة 24 ساعة.

لبدء التمايز العصبي ، دع الركام يستقر في أنابيب المفاعل الحيوي ويستنشق بعناية المادة الطافية من الخلايا ، تاركا حوالي خمسة ملليلتر من المادة الطافية في الأنبوب. ثم أضف 35 ملليلتر من وسط الحث العصبي الذي يتكون من وسط عصبي قاعدي واثنين ميكروغرام لكل ملليلتر من الدوكسيسيكلين. ضع الأنابيب مرة أخرى في المفاعل الحيوي الموجود على مقاعد البدلاء واستمر في الزراعة.

قم بإجراء تغييرات الوسائط كل يوم لمدة يومين ، كما هو موضح سابقا. بعد استنشاق المادة الطافية كما هو موضح سابقا ، انقل الركام إلى أنبوب معقم سعة 15 ملليلتر أو 50 ملليلتر وشطف الركام برفق مرتين باستخدام DPBS. استنشاق بعناية طاف قدر الإمكان دون إزعاج الركام.

ثم أضف 2 إلى 5 ملليلتر من إنزيم تفكك الخلايا المسخن مسبقا إلى الحبيبات ، اعتمادا على حجم الحبيبات ، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق تقريبا عند 37 درجة مئوية في حمام مائي. أعد تعليق الركام المترسب برفق كل دقيقتين حتى ينفصل الركام. أضف وسطا عصبيا قاعديا مدفئا مسبقا ، ثلاثة أضعاف حجم إنزيم تفكك الخلايا المضاف سابقا ، وأعد تعليق الخلايا بعناية لضمان تفرد الخلية.

حدد أعداد الخلايا وانقل الحجم المناظر من معلق الخلية للحفظ بالتبريد إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا أو 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي إلى الخلايا في 300 غرام لمدة ثلاث دقائق. نضح المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في الحجم المقابل لوسط التجميد الذي يحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد.

قسمة تعليق الخلية في قوارير مناسبة للحفظ بالتبريد. انقل القوارير على الفور إلى حاوية تجميد بطيئة التبريد مسبقا مملوءة ب 2-بروبانول وضع الحاوية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل. ضع القوارير عند 150 درجة مئوية تحت الصفر في اليوم التالي للتخزين طويل الأجل.

بعد فصل الثقافات الملتصقة ب iPSCs البشرية ، وتفريغها ، ونقلها إلى التعليق ، تشكلت الركام في غضون 24 ساعة واستمرت في النمو. بعد يومين من تحريض الجينات المحورة ، يمكن حفظ الخلايا العصبية المبكرة بالتبريد للنضج اللاحق. لوحظ الانتشار المستمر ل iPSCs البشرية خلال الأيام الأولى في التعليق ، وبلغ عدد زراعة الخلايا ذروته بعد يومين من التحريض.

ومع ذلك ، فإن الزراعة المطولة لأكثر من أربعة أيام في التعليق لم تحسن إنتاج الخلايا ، حيث أصبحت الركام مقاومة بشكل متزايد للتفرد الأنزيمي. علاوة على ذلك ، مقارنة باليوم صفر ، زاد القطر الإجمالي بنسبة 50٪ في اليوم الثاني وتضاعف تقريبا في اليوم الخامس. على الرغم من أن زيادة القطر تحد من إمدادات المغذيات إلى الركام ، إلا أن صلاحية الخلايا لم تتأثر في اليوم الثاني أو الخامس من التمايز.

أكد ملف تعريف التعبير الجيني الزمني بالإضافة إلى التلوين الكيميائي المناعي للعلامات العصبية بيتا ثلاثة توبولين والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة ، أو MAP2 ، هوية الخلايا العصبية للخلايا المحفوظة بالتبريد في اليوم الثاني. بالإضافة إلى ذلك ، تم إثراء الثقافات العصبية في نسخ بروتين تاو المرتبط بالأنابيب الدقيقة ، أو MAPT ، وأظهرت انخفاضا مصاحبا في التعبير عن عامل النسخ المنظم متعدد القدرات POU5F1 تم تشكيل شبكة عصبية كثيفة خلال الأسبوع الأول بعد ذوبان الجليد ، مما يشير أيضا إلى زيادة نضج الثقافات العصبية. يضع هذا البروتوكول الأساس للترجمة إلى مفاعلات حيوية واسعة النطاق ومؤتمتة بالكامل ، والتي تظهر زيادة كبيرة أخرى في قدرة إنتاج الخلايا للتطبيقات المستقبلية واسعة النطاق.

بمجرد إثبات ذلك باستخدام neurogenin 2 ، تم تطبيق استخدام عوامل النسخ المحددة الخطية لتسريع التمايز على العديد من أنواع الخلايا والأمراض المختلفة لتسهيل نمذجة iPSC.