استخدام الكواشف المرجعية لتأكيد متانة فحوصات إطلاق السيتوكين للتنبؤ بسلامة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة

يعد اختبار سلامة الأدوية الجديدة أمرا بالغ الأهمية ، ويصف هذا البروتوكول كيفية استخدام المعايير التي تم التحقق من صحتها لتقييم قابلية التكاثر والمتانة والقيود المحتملة لمنصة CRS. تم التحقق من صحة هذه التقنية باستخدام هذه الكواشف في 11 مختبرا مختلفا ودراسة تعاونية دولية مع أنماط مماثلة من الاستجابة لوحظت ، وبالتالي تحسين الجهود المبذولة في المواءمة والتكاثر. تمتد تطبيقات هذه التقنية نحو تحسين اختبار مخاطر CRS للأجسام المضادة العلاجية الجديدة ، وستساعد أيضا على الاستعداد للإدارة السريرية للآثار الجانبية المحتملة.

يهدف هذا العمل إلى تحسين قابلية التكرار والمواءمة ، ويعزز العرض المرئي فرص التكرار. ابدأ بإعادة تشكيل محتويات أمبولات الكاشف المرجعي في مليلتر واحد من الماء المقطر المعقم والسماح ب 5 إلى 10 دقائق من إعادة الجفاف. بعد ذلك ، امزج كل محلول من محلول الأجسام المضادة بشكل صحيح قبل نقله إلى أنبوب معقم مغطى.

بعد ذلك ، قم بتخفيف كل جسم مضاد معاد تكوينه واختبار الجسم المضاد إلى 10 ميكروغرام لكل مليلتر في PBS المعقم. خذ صفيحة ميكروتيتر معقمة غير معالجة ب TC ومصنوعة من مادة البولي بروبيلين 96 بئر وأضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة المخفف المطلوب إلى الآبار المخصصة للوحة. بعد ذلك ، احتضان اللوحة طوال الليل عند أربع درجات مئوية قبل إجراء فحص الطور الصلب.

بعد جمع ما لا يقل عن 30 مل من الدم الكامل المحيطي في أنبوب هيبارين ، قم بقلبه عدة مرات لضمان الخلط الصحيح لعينة الدم مع هيبارين الصوديوم. ضع جانبا 15 مل من عينة الدم الكاملة في أنبوب منفصل لاستخدامها لاحقا في المرحلة المائية من فحص الدم الكامل. قم بتخفيف ال 15 مل المتبقية من الدم الكامل عن طريق إضافة حجم متساو من وسائط PBS أو وسائط RPMI 1640 الخالية من المصل.

ضع طبقة من الدم المخفف برفق فوق 15 مل من وسط تدرج الكثافة في أنبوب سعة 50 ملليلترا. قم بالطرد المركزي للأنبوب باستخدام دوار متأرجح بدون فرامل وتسارع منخفض عند 500 جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لفصل الدم إلى مكوناته المختلفة. بعد الطرد المركزي ، سينفصل تدرج الكثافة كطبقة علوية من البلازما ، تليها طبقة رقيقة من طبقة مصفرة تحتوي على PBMCs وطبقة سفلية تحتوي على كرات الدم الحمراء والخلايا الحبيبية متعددة الأشكال ، بما في ذلك العدلات والحمضات.

قم بإزالة طبقة البلازما العلوية بعناية ، متبوعة بالطبقة التالية ، لحصاد PBMCs. للغسيل ، أعد تعليق الطبقة المصفرة المحصودة في 10 مل من PBS أو وسائط RPMI 1640 الخالية من المصل. الطرد المركزي يبدأ الأنبوب عند 500 جم لمدة 10 دقائق لحبيبات الخلايا.

تخلص من المادة الطافية وكرر الغسيل مرة أخرى. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات الناتجة في ملليلترين من وسائط RPMI الكاملة. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم واضبط تركيز PBMC إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر في RPMI الكامل.

بالنسبة لمقايسة إطلاق سيتوكين الدم الكامل للمرحلة المائية ، خذ عينة الدم الكاملة الموضوعة جانبا مسبقا ، وأضف 190 ميكرولترا من العينة إلى آبار صفيحة البوليسترين ذات القاع U المكونة من 96 بئرا ، والأجسام المضادة للمعالجة الحرارية والكواشف المرجعية المخففة مسبقا إلى 100 ميكروغرام لكل مليلتر في PBS ، وأضف 10 ميكرولترات من الجسم المضاد المخفف المطلوب إلى الآبار المخصصة التي تحتوي على 190 ميكرولتر من الدم الكامل. احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية. بالنسبة لمقايسة إطلاق السيتوكين PBMC للمرحلة الصلبة ، احصل على الألواح المطلية المعدة مسبقا.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، تخلص من محلول الجسم المضاد من الألواح المطلية. بعد ملء خزان الكاشف ب PBS ، اغسل اللوحة ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من PBS لإزالة الأجسام المضادة أحادية النسيلة غير المرتبطة. أضف 200 ميكرولتر من تعليق PBMC المعد مسبقا إلى كل بئر.

احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة لمدة 48 ساعة مع التحكم والاختبار في الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، قم بالطرد المركزي للألواح عند 400 جم لمدة خمس دقائق. اجمع الوسط أو البلازما المكيفة للخلية دون إزعاج حبيبات الخلية.

قم بتجميد المادة الطافية أو البلازما المجمعة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. أظهرت نتائج فحص الطور الصلب PBMC أن الأجسام المضادة للتحكم الإيجابي تسببت في مستويات عالية بشكل كبير من السيتوكينات عند مقارنتها بضوابط النمط المتطابق. لوحظ أيضا أن الناهض الفائق المضاد ل CD28 تسبب في تغيير أضعاف أكبر بكثير في إنترلوكين -2 ، أو إطلاق IL-2 ، من النمط المتطابق له ، في حين أن مضاد CD3 ومضاد CD52 ، بينما لا يزالان يحفزان تعبير IL-2 ، أدت إلى تغييرات في الطي المنخفض.

في مقايسة الطور المائي للدم الكامل ، كان مستوى السيتوكينات التي يمكن اكتشافها أقل نسبيا مما كان عليه في مقايسة الطور الصلب ، ولكنه تميز بحساسية أكبر للتحفيز بواسطة مضاد CD52.