توليد كرويات الورم 3D لدراسات تقييم المخدرات
February 24th, 2023
توضح هذه المقالة طريقة موحدة لبناء كرويات الورم ثلاثية الأبعاد. كما تم وصف استراتيجية للمراقبة الكروية وتحليل التعلم العميق القائم على الصور باستخدام نظام التصوير الآلي.
أظهر هذا البروتوكول طريقة موحدة لبناء أورام ثلاثية الأبعاد من الأجسام الكروية. وقدمت هذه المنهجية دائرة عالية وتحليل محتوى عالي لتركيبات الورم 3D. باستخدام طريقة قياسية لبناء كروي الورم ونظام تصوير وتحليل عالي الإنتاجية ، يمكن زيادة فعالية ودقة اختبارات الأدوية التي تشكلت على كرويات ثلاثية الأبعاد بشكل كبير.
في هذا البروتوكول ، استخدمنا AMG510 لعلاج كروي NCI-H23 كمثال. من التجربة ، يمكننا ملاحظة تأثير كبير للدواء السرطاني المستهدف على كرويات الورم. للبدء ، ماصة 100 ميكرولتر من كاشف مضاد الالتصاق في كل بئر من صفيحة بئر 48 مع قاع بئر على شكل حرف U واحتفظ بها لمدة 10 دقائق.
بعد 10 دقائق ، نضح كاشف الطلاء واغسله مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني معقم. ضع طبق الاستزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية في هواء مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الاستخدام. مراقبة الخلايا تحت المجهر.
بعد ذلك ، اغسل الخلايا المزروعة في قارورة T25 مرتين باستخدام PBS لإزالة وسط المزرعة ومعالجة الخلايا الموسعة بملليلتر واحد من 0.25٪ trypsin EDTA لمدة دقيقة إلى دقيقتين في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تأكيد شكل الخلية تحت المجهر. ثم أوقف علاج التربسين عن طريق استنشاق معلق التربسين EDTA المستخدم في قارورة T25 وغسل الخلايا بأربعة ملليلتر من الوسط الطازج.
انقل كل المعلق إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا واستخدم ملليلترا واحدا من الوسط الطازج لغسل الخلايا المتبقية وإضافته إلى الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 186.48 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية. أضف 10 ملليلتر من الوسط الطازج إلى حبيبات الخلية وماصة بلطف حتى تصبح الخلايا في تعليق متجانس.
نضح 0.1 ملليلتر من تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي جديد. أضف 0.9 ملليلتر من الوسط الطازج ثم ماصة التعليق جيدا. استخراج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية لعد الخلايا.
كرر هذه العملية مرة أو مرتين وخذ قيمة متوسطة. تمييع التعليق للوصول إلى كثافة البذر النهائية من 50،000 خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة قاع U 48 بئرا.
لف فيلم الختم حول اللوحة وجهاز الطرد المركزي عند 119.35 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، اسحب الفيلم الواقي وأضف خمسة إلى ثمانية ملليلتر من الماء المعقم في قناة المياه المحيطة بالآبار. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام.
لا تقم بتغيير أو تكملة أي ماء إلى قناة المياه خلال هذه الفترة ولاحظ تجمع الخلايا خلال الأيام الخمسة التالية. لتضمين الجل ، بعد إخراج الجل المجمد من الثلاجة التي تبلغ درجة حرارتها 20 درجة مئوية تحت الصفر ، ضعه على صندوق ثلج طوال الوقت أثناء التجربة. مراقبة كرويات الخلية تحت المجهر.
قبل أن يبدأ تضمين الجل ، يجب التحقق من حالة الأجسام الكروية مرة أخرى. قم بإزالة 150 ميكرولترا من الوسط بعناية وقم بتضمين كل كروي في الجل عن طريق إضافة الجل السائل ببطء من جانب جدار البئر أثناء تحريك طرف الماصة المبرد مسبقا حول البئر وداخله. انتظر لمدة خمس دقائق وإذا لم ينتشر الجل بالتساوي ، ماصة الجل برفق بطرف ماصة 10 ميكرولتر.
يحتوي كل بئر على ورم كروي ، 25 ميكرولتر من 3.5 ملليغرام لكل هلام ملليلتر ، و 50 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل. أضف 75 ميكرولترا من الوسط إلى عناصر التحكم أيضا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يكتمل الهلام المائي بالكامل.
تأكيد حالة الهلام تحت المجهر. تراكب 125 ميكرولتر من الوسط الطازج على كل عينة وزراعة الكرويات لمدة 7 إلى 10 أيام أخرى. قم بإعداد مجموعات من الأجسام الكروية مع أربعة إلى ستة آبار لكل منها واختر ثلاثة منها على الأقل للتحليل.
حل الدواء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وإعداد حلول العمل 100 أضعاف مع DMSO. استخدم 0.1٪ DMSO كعنصر تحكم إيجابي وأضف 125 ميكرولترا من الوسط المعالج بالعقاقير إلى كل بئر. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في هواء مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في هذه المرحلة ، يحتوي كل بئر على ورم كروي ، 25 ميكرولتر من 3.5 ملليغرام لكل هلام ملليلتر ، و 175 ميكرولتر من الوسط. تحتوي عناصر التحكم على 200 ميكرولتر من الوسط. قم بقياس الصلاحية الكروية باستخدام مجموعة مقايسة alamarBlue وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
نضح 100 ميكرولتر من الوسط الطافي من كل بئر إلى لوحة اختبار جديدة. بعد ذلك ، قم بقياس الجدوى باستخدام مقياس ضوئي للصفائح الدقيقة. قم بقياسه في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10 بعد تضمين الكرات في الجل.
أضف 80 ميكرولترا من الوسط الطازج إلى كل بئر من طبق الاستزراع. ثم استبدل 100 ميكرولتر أخرى من الوسط المعالج بالعقاقير. تأكد من عدم وجود بقايا من الامار بلو في البئر.
نضح 100 ميكرولتر من الوسط قبل التصوير ووضع اللوحة على المسرح. الحصول على صور رقمية للكرويات باستخدام مجهر آلي بهدف عشرة أضعاف. يمكن للمجهر تركيز هذه الكرويات ومركزيتها تلقائيا.
انتظر التصوير التلقائي. يتم الحصول على أربع صور لكل كروي. يتم تشكيل صورة متكاملة ومعالجتها باستخدام البرنامج المتصل بنظام التصوير عالي المحتوى.
انقر فوق زر عملية تصحيح الصور واختر الصور المدمجة في البرنامج. اختر نموذج U net واكتب معدل التحويل. انقر في الجزء السفلي من الشاشة لبدء معالجة الصور.
احفظ بيانات القطر والمحيط والخشونة في برنامج جداول البيانات. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط الطازج مع الدواء وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في الهواء المرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. يظهر في هذا الشكل صور برايت فيلد لكرويات الخلايا NCI-H23 المعالجة بتركيزات مختلفة من AMG510 والتي تم التقاطها تلقائيا بواسطة مجهر عالي المحتوى.
تمثل الأعمدة أياما مختلفة وتمثل الصفوف تركيزات مختلفة من المخدرات. وتشمل النتائج ثلاث كرويات لكل حالة. تم قياس صلاحية كروية الورم لمجموعات العينات المعالجة AMG510 في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10.
يظهر هذا الشكل صلاحية الخلية الطرفية للعينات ذات تدرجات التركيز. تم قياس أقطار كروية الورم في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10. تم تعريف نسبة النمو الكروي على أنها الحجم النهائي بالنسبة للحجم الأصلي وحسابها باستخدام أقطار كروية.
تم تعريف نسبة تثبيط النمو الكروي بالنسبة للحجم وحسابها باستخدام أقطار كروية. تم قياس خشونة الورم بواسطة البرنامج في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10 ، مما يشير إلى غزو كرويات الورم. تم تحديد محيط الكروي ورسمه بواسطة البرنامج باستخدام خوارزميات التعلم العميق.
ثم تم قياس المناطق الكروية في المستوى البؤري بواسطة الصورة J وتم حساب مؤشر محيط زائد بناء على هذه البيانات. على الرغم من سهولة متابعة هذه الرسالة ، إلا أن العينات لا تزال بحاجة إلى التعامل معها بعناية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
توضح هذه المقالة طريقة موحدة لبناء كرات ورمية ثلاثية الأبعاد. تعمل المنهجية على تحسين فعالية ودقة اختبارات الدواء على هذه الكرات من خلال التصوير والتحليل عالي الإنتاجية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- طب الأورام
- تقنيات التصوير
الخلفية
- تعتبر كرات الورم ثلاثية الأبعاد مهمة لأبحاث السرطان.
- تحسن الطرق الموحدة التكرارية في التجارب.
- تسهل أنظمة التصوير الآلية تحليل التعلم العميق.
- يمكن أن ينتج اختبار الدواء على الكرات نتائج أكثر دقة.
غرض الدراسة
- لإنشاء طريقة موثوقة لبناء الكرات.
- لتوضيح استخدام AMG510 على كرات NCI-H23.
- لتعزيز منهجيات اختبار الدواء باستخدام الإنشاءات ثلاثية الأبعاد.
الطرق المستخدمة
- تقطير عامل مضاد للالتصاق في آبار لوحة 48 بئر.
- بناء كرات ورمية ثلاثية الأبعاد.
- استخدام أنظمة التصوير عالي الإنتاجية.
- تطبيق تحليل التعلم العميق للمراقبة.
النتائج الرئيسية
- تمت ملاحظة تأثيرات كبيرة للأدوية المستهدفة على كرات الورم.
- حسنت الطريقة الموحدة دقة اختبارات الدواء.
- وفر تحليل المحتوى العالي رؤى تفصيلية حول سلوك الكرات.
- سهل التصوير الآلي جمع البيانات بكفاءة.
الاستنتاجات
- الطريقة الموحدة فعالة لبناء كرات الورم.
- يعزز التصوير عالي الإنتاجية دقة اختبار الدواء.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسات أبحاث السرطان المختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Standardized 3D tumor spheroid generation and high-throughput imaging address critical gaps in predictive drug evaluation for oncology pipelines. This workflow enhances translational relevance and quantitative rigor, supporting more confident early-stage portfolio decisions. Integration of automated analysis and reproducible spheroid models reduces biological ambiguity and improves cross-study comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of therapeutic hypotheses in a physiologically relevant 3D context.
- Supports functional target validation by quantifying drug effects on tumor-like structures.
- Improves predictive confidence for advancing oncology targets through standardized viability and growth metrics.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of uniform, manipulable spheroids for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative outputs such as viability, diameter, and roughness for assay standardization.
- Enables high-throughput, automated imaging and AI-driven analysis for scalable screening workflows.
- Supports reliable evaluation of compound efficacy in a 3D tumor model system.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro drug response data with disease-relevant 3D tumor biology.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by modeling tumor growth and invasiveness.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, translationally relevant endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, screening, and preclinical research by providing a standardized, scalable platform for drug evaluation in 3D tumor models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through quantitative viability and growth inhibition metrics.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible spheroids and automated imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content, quantitative readouts including diameter, perimeter, roughness, and viability for comparative analysis.
- Translational Research: Models tumor invasiveness and drug response in a system aligned with in vivo tumor biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for oncology drug evaluation across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in oncology drug discovery.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of 3D drug testing workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and high-content imaging analysis.
- Needs access to automated microscopy and AI-based image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of spheroid preparation and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different cell lines or tumor types.
- Careful sample handling is essential to maintain spheroid integrity and data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Spheroid Construction
5:38
Drug Treatment and Spheroid Viability
7:09
Spheroid Observation and Deep Learning Analysis Through Images in the Drug Test
8:23
Results: Brightfield Images of NCI‐H23 Cell Spheroids Treated with AMG510, Tumor Spheroid Viability, Tumor Size and Invasiveness
10:09
Conclusion
