عزل وتوصيف واستخلاص الحمض النووي الكلي لتحديد الفطريات الداخلية في النباتات الفطرية ذاتية التغذية
مايو 5, 2023
تهدف المقالة الحالية إلى توفير بروتوكولات مفصلة وكافية لعزل الفطريات الداخلية المرتبطة بالنباتات ، والحفاظ على العزلات على المدى الطويل ، والتوصيف المورفولوجي ، واستخراج الحمض النووي الكلي لتحديد الجزيئات اللاحقة والتحليلات الميتاجينومية.
التقنيات المعروضة هنا مفيدة لدراسة مجتمع الفطريات الداخلية المرتبط بأعضاء النبات المختلفة. يسمح عزل الفطريات الداخلية بتحديدها ، وهي ذات قيمة في تقنيات أخرى مثل الإنبات التكافلي. للبدء ، قم بإعداد ثمانية إلى 10 سنتيمترات من أطباق بتري متوسطة لثقافة المساعد الشخصي الرقمي تستكمل بثلاثة ملليلتر لكل لتر من المضادات الحيوية.
تحقق من التلوث عن طريق احتضان أطباق بتري المتوسطة المستزرعة عند 36 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل الاستخدام. في اليوم التالي ، قم بتطهير شظايا النباتات الفطرية الصحية بشكل سطحي باستخدام إجراء قياسي ووضعها في طبق بتري معقم. لتقييم فعالية التطهير السطحي للعينات ، قم بتلقيح بضع قطرات من الماء المقطر المستخدم أثناء الغسيل الأخير للعينات على القناة الشريانية السالكة (PDA).
بعد ذلك ، باستخدام مشرط ملتهب وملقط ، قسم العينات إلى قطع بسمك 0.2 سم. قسم العينات لتضخيم مساحة السطح لتكون على اتصال مع الوسط. ضع خمس شظايا من الأعضاء الجوفية في لوحة PDA المكملة بالمضاد الحيوي بعيدا قدر الإمكان دون لمس حواف الطبق.
ختم أطباق بتري مع فيلم تتشبث ، وتخزينها في الظلام في 25 إلى 27 درجة مئوية لمدة خمسة أيام. قبل يوم من الزراعة الفرعية ، قم بإعداد أطباق بتري خمسة سنتيمترات باستخدام خمسة إلى سبعة جرامات لكل لتر AA ، واحتضان الأطباق عند 36 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لتنقية العزلات الفطرية ، قم بتمييز مستعمرات لوحة PDA حسب اللون ونمط النمو والملمس وتنسيق الهامش.
ثم حدد هوامش المستعمرة على الجانب السفلي من الطبق. حدد أيضا المستعمرات برمز. باستخدام طرف عود أسنان خشبي معقم ، استرجع كمية صغيرة من الفطريات من هوامش المستعمرة الفطرية المحددة وقم بتخطيط لوحة AA ، مما ينتج عنه ثلاثة خطوط على بعد سنتيمتر واحد من بعضها البعض وحواف الطبق.
قم بتسمية لوحة AA بالكود المناسب باستخدام ورق لاصق وقلم رصاص. أغلق الألواح قبل حضنها في الظلام عند 25 إلى 27 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. بعد الحضانة ، راقب بدقة اللوحات لتحديد الخيوط الدقيقة التي تشكل مستعمرات فردية.
حدد مساحة المستعمرات الفردية باستخدام علامة دائمة. قم بقطع جزء من الوسط الذي يحتوي على المستعمرة باستخدام عود أسنان معقم ، وانقل حجم القطع إلى مركز صفيحة PDA Petri جديدة بدون مضادات حيوية. بعد تسمية أطباق بتري برموز العزلات ، قم بإغلاقها بغشاء ملتصق ، واحتفظ بها في الظلام عند 25 إلى 27 درجة مئوية لمدة سبعة إلى 14 يوما.
لبدء الحفاظ على العزلات الفطرية باستخدام طريقة Castellani ، أضف 0.5 ملليلتر من الماء المقطر إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعقم بملليلتر. باستخدام عود أسنان معقم ، قم بقطع وسط مكعب 0.5 × 0.5 سم من هوامش الفطريات للعزلات النقية المزروعة بالفعل. ضع أربعة إلى ستة متوازي المستطيلات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بالماء المقطر.
قم بتخزين الأنابيب في الظلام عند 25 درجة مئوية طالما دعت الحاجة. عند الحاجة ، استرد متوازي المستطيلات وضعه في وسط طبق PDA جديد لزراعة عزلة مخزنة. ابدأ طريقة تثبيت ندف عن طريق وضع قطرة من بقعة Toluidine blue-O على شريحة زجاجية نظيفة.
يمكن استخدام بقع مختلفة في مثل هذه التقنية. باستخدام عود أسنان معقم ، قم بإزالة بعض الخيوط بعناية من العزلة المزروعة ، وضعها في قطرة البقعة. ضع زلة غطاء وقم بتحليلها تحت المجهر الضوئي.
بالنسبة لطريقة تركيب الشريط اللاصق ، ضع قطرة من بقعة قطن اللاكتوفينول الزرقاء على شريحة زجاجية نظيفة. قطع شريط من شريط لاصق شفاف في حجم يناسب الشريحة الزجاجية وبقعة بقعة مركزية جيدا. قم بتوجيه السطح اللاصق للشريط اللاصق إلى سطح الفطريات ، وحاول جمع بعض الخيوط دون الضغط أو جمع الكثير منها.
ثم قم بلصق الشريط على الشريحة الزجاجية ، مع التأكد من ملامسة البقعة للخيوط التي تم جمعها. ضع قطرة ماء فوق الشريط وضع قسيمة غطاء قبل تحليل الشريحة تحت المجهر الضوئي. لوحظ نمو مجموعات صغيرة من الفطريات الفطرية الخيطية الخارجة من داخل الشظايا بعد خمسة أيام من تلقيح جزء العضو النباتي الفطري على وسط PDA.
خلال سبعة إلى 14 يوما من تلقيح العزلة المنقاة ، لوحظ نمو الطرد المركزي لمستعمرة عزل الفطريات النقية على PDA ، مما شكل فطريات دائرية وحيدة. تم تحديد الملوثات المحتملة بسهولة ، مما يعرض تجانس المستعمرة للخطر فيما يتعلق بجانب شكل نموها ولونها وإنتاج الصباغ في الوسط. كانت المستعمرة المعزولة من الجذور المغزلية للأوركيد الفطري ، Wullschlaegelia aphylla ، معتمة مع عدم وجود أصباغ أو إفرازات قابلة للانتشار في الوسط.
كانت المستعمرة بيضاء إلى رمادية على الجانب العلوي ، وبنية على الجانب السفلي. كانت الفطريات جوية وفيرة ، وكانت الهوامش غير منتظمة وجوية. كان للمستعمرة نسيج مخملي ، وتضاريس مجعدة بدون هياكل عيانية.
تم عرض الهياكل التي لم تكن مرئية بسهولة في الفطريات غير الملوثة بعد تلطيخ الفطريات الفطرية بقطن اللاكتوفينول الأزرق والأزرق التولويدين ، مما يسهل التعرف عليها. يمكن أيضا تطبيق طرق العزل الفطري المعروضة هنا على النباتات الخضراء لتحديد النباتات الداخلية الفطرية. يمكن استخدام الفطريات المعزولة في تجارب الإنبات التكافلي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في طرق عزل وحفظ الفطريات المرتبطة بالنباتات، مع التركيز على أهميتها في البحوث البيولوجية. تهدف البروتوكولات المحددة إلى تمكين التعرف الدقيق والدراسات الجزيئية الإضافية لهذه المجتمعات الفطرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- الفطريات المرتبطة بالنباتات
- تقنيات عزل الفطريات
- التعرف الجزيئي والتحليلات الميتاجينومية
الخلفية
- تعيش الفطريات المرتبطة بالنباتات داخل الأنسجة النباتية دون أن تسبب أعراضًا
- تلعب أدوارًا حاسمة في صحة النبات وتطوره
- فهم هيكل المجتمع الفطري حيوي للبحث الزراعي والبيئي
الطرق المستخدمة
- تقنيات الثقافة المعقمة لعزل الفطريات
- التحليل المجهري للهياكل الفطرية
- طرق الحفظ للتخزين طويل الأمد للعزلات الفطرية
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للفطريات المرتبطة بالنباتات من النباتات الميشوتروتروفية
- تمييز واضح للمستعمرات الفطرية بناءً على الخصائص المورفولوجية
- تأسيس بروتوكولات فعالة لتنقية وتحليل وراثي
الاستنتاجات
- توفر الدراسة طرقًا موثوقة لعزل وحفظ الفطريات المرتبطة بالنباتات
- تعزز هذه الطرق فهم التنوع الفطري وأهميةه البيئية
الأسئلة المتكررة
Executive Industry Relevance
Isolation and molecular characterization of endophytic fungi from mycoheterotrophic plants provide foundational tools for understanding plant-fungal symbioses relevant to biopharma discovery. These protocols enable the identification and preservation of diverse fungal communities, supporting hypothesis-driven research into plant-microbe interactions and their translational potential. Integrating both culture-dependent and culture-independent workflows enhances predictive confidence in early-stage target validation and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of plant-fungal symbiotic mechanisms for target validation.
- Supports biological de-risking by distinguishing culturable and non-culturable fungal taxa.
- Facilitates predictive confidence in selecting relevant endophyte-plant associations for further study.
Screening & Assay Development
- Prepares validated fungal isolates for downstream functional assays and symbiotic germination trials.
- Standardizes morphological and molecular identification for reproducible screening workflows.
- Enables scalable maintenance and reuse of fungal collections for comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns fungal community profiling with translational biomarker discovery in plant-microbe systems.
- Supports continuity from ecological discovery to preclinical model development where relevant.
- Provides mechanistic de-risking for candidate endophyte selection in translational research.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols position fungal isolation and DNA extraction at the interface of early discovery and assay development, bridging ecological sampling with molecular analytics.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on endophyte diversity and plant-fungal specificity.
- Screening: Delivers reproducible, morphologically and molecularly characterized isolates for assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative colony and DNA outputs for comparative condition analysis.
- Translational Research: Supports alignment of fungal profiles with disease-relevant or symbiotic biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolate and DNA resource for ongoing R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in plant-microbe target validation.
- Operational Value: Standardizes isolation, preservation, and molecular workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and portfolio prioritization by clarifying endophyte diversity and function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of plant-microbe research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, fungal morphology, and molecular biology.
- Needs access to culture facilities, microscopy, and DNA extraction infrastructure.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data comparability.
- Adaptable to diverse plant systems but may require protocol optimization for specific tissues.
- Limitations include potential underrepresentation of non-culturable fungi in culture-dependent workflows.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:21
Isolation of Endophytic Fungi Associated with Plant Organs
3:12
Preservation of Purified Fungal Isolates
4:01
Micromorphological Characterization (Hyphal Morphology) of Filamentous Fungi
5:10
Results: Isolation and Macromorphology Evaluation of Endophytic Fungi Associated with Mycoheterotrophic Plants
6:33
Conclusion
