Name: تحضير كامل قائم على الميثانول لفحص خلايا العقدة الشبكية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 47 s
Description: تعلم طريقة تحضير كامل قائم على الميثانول لعزل وتحضير شبكية العين لدراسة خلايا العقدة الشبكية. تتيح هذه التقنية الحفظ طويل الأمد للعينات دون الحاجة إلى التصبيغ الفوري.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم تمويل هذا العمل من قبل مشروع افتتاح مختبرات هوبي الرئيسية (المنحة رقم 2021KFY055) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هوبي (منحة رقم 2020CFB240) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (منحة رقم 2042020KF0065).

يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. تم الحصول على جميع الفئران C57BL / 6J المستخدمة من مركز المختبر بجامعة ووهان ، وتمت الموافقة على جميع التجارب ذات الصلة من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات بجامعة ووهان. بذلت كل الجهود لتقليل معاناة الفئران.
1. استئصال وتثبيت العينين
<ol><li>القتل الرحيم للفئران بالاختناق بثاني أكسيد الكربون ، واستئصال مقلة العين بلطف باستخدام ملاقط بلا أسنان.</li>
	<li>شطف مقلة العين مرة واحدة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).</li>
	<li>ثقب مقلة العين بإبرة حقنة في القرنية تحت المجهر (العدسة WF: 10x / 22 ؛ هدف التكبير المستمر: 0.67x-4.5x) لتسريع التثبيت في مقلة العين وتحسين كفاءة التثبيت.</li>
	<li>نقل إلى لوحة 24 بئر تحتوي على 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA).</li>
	<li>ثبت مقلة العين في 4٪ PFA لمدة 45 دقيقة ، ثم انقلها إلى 1x PBS لإزالة PFA الزائد (اغسل ثلاث مرات ، 5 دقائق / وقت) على الفور.</li>
</ol>2. عزل الشبكية وتسطيحها
<ol><li>انقل مقلة العين إلى شريحة زجاجية ، وضعها تحت مجهر تشريح (العدسة WF: 10x / 22 ؛ هدف التكبير المستمر: 0.67x-4.5x).</li>
	<li>امسك الملقط بيد واحدة ، واستخدمه لتثبيت هامش القرنية لمنع حركة مقلة العين. استخدم اليد الأخرى لإمساك مقص التشريح وقطع القرنية على عمق 1 مم تقريبا من خلال ليمبوس القرنية الصلبة. قم بإزالة العدسة والجسم الزجاجي.</li>
	<li>امسك القرص البصري في المركز ، وباستخدام مقص التشريح ، قم بقطع الشبكية شعاعيا على طول الأرباع الأربعة ، لتصل إلى حوالي 2/3 من نصف قطر الشبكية.</li>
	<li>المشبك واحدة من حواف الصلبة باستخدام ملقط مسنن. من ناحية أخرى ، أمسك حافة الصلبة بالملقط غير المسنن ، وانتقل من حيث يتم تثبيت الصلبة بواسطة الملقط المسنن نحو قاعدة الصلبة. قشر بعناية شبكية العين.</li>
	<li>اسحب برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة (200 ميكرولتر) لغسل شبكية العين وتبليلها ، ثم قم بإزالة أي PBS زائد بقطعة صغيرة من الورق الماص. إذا لزم الأمر ، قم بتسطيح شبكية العين برفق باستخدام فرشاة شعيرات صغيرة.</li>
	<li>يسقط الميثانول البارد الماص ببطء (المبرد مسبقا في الفريزر -20 درجة مئوية) قطرة قطرة على السطح الداخلي للشبكية (حجم الميثانول غير ثابت ، طالما يمكن تغطية الشبكية بالكامل بواسطة الميثانول). تتحول شبكية العين إلى اللون الأبيض وتطور مثابرة متزايدة.</li>
	<li>قم بتسطيح شبكية العين برفق ، وإزالة الشوائب مثل الأغشية الصبغية المتبقية والجسم الزجاجي باستخدام فرش ذات شعيرات صغيرة. اقلب شبكية العين باستخدام فرش ذات شعيرات صغيرة ، وكرر العملية المذكورة أعلاه.</li>
	<li>انقل شبكية العين المعالجة بالميثانول إلى بئر من صفيحة 24 بئرا ، واحتفظ بها غارقة في الميثانول.</li>
	<li>قم بتخزينه في -20 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة للتلطيخ المناعي الفوري ، أو اترك شبكية العين في الميثانول ، وقم بتخزينه في -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.</li>
	<li>قم بإزالة الميثانول من لوحة 24 بئرا ، وشطف شبكية العين باستخدام 1x PBS.</li>
</ol>3. تلطيخ مناعي من RGCs
<ol><li>انقل شبكية العين بعناية إلى صفيحة تراص دموي مكونة من 24 بئرا باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، وقم بحظرها بنسبة 5٪ PBS-TX-BSA (5 جم من مسحوق ألبومين مصل الدم البقري المذاب في 100 مل من محلول 1x PBST ؛ يتم تشكيل PBST بإضافة 10 مل من Triton X-100 إلى 2000 مل من 1 × PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. حافظ على جانب العقدة لأعلى.</li>
	<li>قم بإزالة PBS-TX-BSA ، واحتضان شبكية العين عند 4 درجات مئوية لمدة 48-96 ساعة ، مع إضافة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المختار (الجسم المضاد ل RBPMS لخنزير غينيا) باستخدام تخفيف 1: 400.</li>
	<li>قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي ، واشطف الشبكية ثلاث مرات (20 دقيقة لكل منهما) باستخدام 1x PBS ، مع الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>احتضان شبكية العين مع الهز اللطيف طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المقابل (انظر جدول المواد) ، السيانين Cy3 affiniPure donkey anti-Guinea pig IgG (H + L) ، باستخدام تخفيف 1: 400.</li>
	<li>شطف شبكية العين مع 1x PBS ثلاث مرات (20 دقيقة لكل منهما).</li>
	<li>ضع شبكية العين بشكل مسطح على الشريحة بحيث تكون طبقة الخلايا العقدية متجهة لأعلى ، وقم بإسقاط كمية مناسبة من عامل التبريد المضاد للتألق حول الشبكية باستخدام ماصة ، وقم بتغطية الشريحة بغطاء (احرص على عدم وجود فقاعات). ملاحظة: لتحديد الكمية المناسبة من المروي المضاد للتألق ، تأكد من أنه يغطي شبكية العين بأكملها. بعد ذلك ، قم بتغطية الشريحة دون السماح لشبكية العين بالطفو والتحرك بسهولة.</li>
	<li>أغلق الشريحة في كل مكان بعامل مانع للتسرب لمنعها من الحركة. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -20 درجة مئوية وحمايتها من الضوء.</li>
	<li>تخيل شبكية العين باستخدام مجهر مضان / متحد البؤر.</li>
</ol>

عزل شبكية الفأر وعلاج الميثانول لدراسة خلايا العقدة الشبكية

<ol><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+types+of+retinal+ganglion+cells%3A+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%2C+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).</li>
<li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma%3A+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li>
<li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+glaucomatous+damage%3A+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li>
<li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).</li>
<li>Nadal-Nicolás, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moniliform+deformation+of+retinal+ganglion+cells+by+formaldehyde-based+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).</li>
<li>Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+methods+for+three-dimensional+reconstructions+from+confocal+images%3A+I.+Tissue+shrinking+and+axial+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).</li>
<li>Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+wide-ranging+panel+of+antigens+in+the+rat+retina+by+immunohistochemistry%3A+Comparison+of+Davidson%27s+solution+and+formalin+as+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).</li>
<li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology%3A+A+comparison+with+Davidson%27s+fixative+and+other+fixation+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li>
<li>Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fixation+of+the+whole+bodies+of+fish+by+a+double-fixation+method+with+formalin+solution+and+Bouin%27s+fluid+or+Davidson%27s+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).</li>
<li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin%3A+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59(2012).</li>
<li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine%2C+conjunctiva%2C+and+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).</li>
<li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li>
<li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Morphologica%22%5BJournal%5D)">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
<li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li>
<li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li>
<li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li>
</ol>

لا يعلم المؤلفون بأي انتماءات أو عضويات أو تمويل أو حيازات مالية قد تؤثر على موضوعية هذه الدراسة.

التثبيت هو خطوة أساسية للحفاظ على شبكية العين ، والتي يمكن أن تؤثر على أي تحقيقات RGC لاحقة بناء على التشكل. يلتقط التثبيت الناجح بسرعة بنية وحالة شبكية العين في لحظة تعريضها لوسط التثبيت ، وهو أمر بالغ الأهمية لمزيد من التحليل. على الرغم من أن الفورمالديهايد يعتبر أحد أكثر عوامل التثبيت شيوعا لتثبيت الأنسجة والخلايا وحفظها ، إلا أن الفورمالديهايد وحده لا يعمل دائما بشكل جيد كمثبت كيميائي مثالي لبعض التحقيقات10,14. أنواع مختلفة من المثبتات لها قدرات متفاوتة لترسي...

خلايا العقدة الشبكية (RGCs) هي الخلايا العصبية الإسقاطية الوحيدة في شبكية العين ، وهي تدمج وتنقل المعلومات المرئية الخارجية إلى الدماغ1. تتميز العديد من الأمراض التنكسية العصبية مثل الجلوكوما والاعتلال العصبي البصري الرضحي بأضرار لا رجعة فيها وفقدان RGCs 2,3. يعد تحليل التغيرات المورفولوجية والكمية ل RGCs خطوة حاسمة في تحديد كيفية تطور الأمراض التنكسية العصبية وتقدمها 4,5.
مقايسة التألق المناعي غير المباشر هي طريقة مقبولة على نطاق واسع لمراقبة توزيع البروتينات وعدد الخلايا. في المختبر ، يشيع استخدام التلطيخ المناعي الكامل للشبكية في الدراسات التجريبية على RGCs لتقييم الظروف الفسيولوجية والمرضية لشبكية العين6. تشمل العلامات الأكثر شيوعا المستخدمة في القياس الكمي ل RGC في شبكية العين بأكملها Brn3a ، بروتين ربط الحمض النووي الريبي مع الربط المتعدد (RBPMS) ، وما إلى ذلك 7,8. يتطلب توصيف كمية وتوزيع RGCs تلطيخا مناعيا عالي الجودة للشبكية بالكامل. بشكل عام ، في بروتوكولات التلوين المناعي ، يتم غمر شبكية العين في المثبتات الكيميائية قبل تحضينها في الأجسام المضادة. يجب ألا تغير المثبتات المثالية شكل الخلايا ، أو إمكانية الوصول أو تقارب الحواتم للأجسام المضادة ، أو الأبعاد الخطية للأنسجة 9,10.
نظرا للبنية المعقدة للشبكية ، فإن مشاكل مثل هشاشة الشبكية وطيها ، بالإضافة إلى بعض الصعوبات الشائعة بما في ذلك انكماش الخلايا والنوى غير الواضحة ، عرضة للحدوث عند صنع رقعة شبكية كاملة ، والتي لها تأثير سلبي على البحث التجريبي. بالإضافة إلى ذلك ، ليست كل شبكية العين ملطخة بالمناعة على الفور ، خاصة عندما يتعلق الأمر بشبكية الفئران المعدلة وراثيا بأسعار باهظة الثمن ذات أصل ثمين ، مما يستلزم الحفاظ على عينات الشبكية الإضافية لاستخدامها مرة أخرى.
يمكن للحل المثبت المناسب إصلاح الأنسجة بسرعة ، وتجنب التحلل الذاتي للأنسجة ، والحفاظ على التشكل الطبيعي وهيكل خلايا الأنسجة ، والحفاظ على مستضدية البروتينات والمواد الأخرى10. في الوقت الحاضر ، تم استخدام التثبيت القائم على الفورمالديهايد على نطاق واسع في الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك شبكية العين المنفصلة ، وأكواب العين الدموية ، ومقل العيون الكاملة10. انكماش الأنسجة والتغيير المورفولوجي للخلايا هما التحديان الحاسمان اللذان تمت مواجهتهما بعد الغمر في الفورمالديهايد11. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر تركيبات التثبيت المعدلة بشكل متزايد لزيادة الاحتفاظ بالخصائص الأصلية لشبكية العين والخلايا المستهدفة 9,10. قد تؤثر علاجات تثبيت الشبكية المختلفة على بنية الشبكية ، ومناعة البروتين ، والإثارة الفلورية ، ودورة تبريد التوهين بشكل مختلف12,13. شبكية العين المثبتة بمحلول ديفيدسون أكثر سلامة من الناحية الشكلية مقارنة بتلك المثبتة بالفورمالين ، لكن محلول ديفيدسون أقل توافقا مع بعض الأجسام المضادة ، مثل جزيء محول ربط الكالسيوم المتأين بعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة 112. بالنظر إلى الطبيعة الهشة لشبكية العين ، سيتساءل الباحثون بطبيعة الحال عما إذا كانت سلامة الشبكية ، وكذلك خصائص وشكل الخلايا المستهدفة ، ستتغير بعد التخزين على المدى الطويل. ومع ذلك ، نادرا ما تم الإبلاغ عن الآثار المحتملة لمحلول التثبيت على مورفولوجيا خلايا الشبكية و RGC بعد التخزين لعدة أشهر. يعد تحسين تثبيت الشبكية أمرا بالغ الأهمية لتقييم وحفظ RGCs.
نحن نقدم وصفا مفصلا لطريقة موثوقة ومباشرة من الناحية الفنية نستخدمها لتلطيخ شبكية الفئران بالكامل. تؤكد طريقتنا على التحضير والتخزين المناسبين لشبكية العين لفحص RGC ، مع الأخذ في الاعتبار الحاجة إلى التخزين طويل الأجل لأنسجة الشبكية بالإضافة إلى جوانب محددة من تكوين الفلوروفور أو تدهوره.

<table><tbody><tr><td>24 بئر مجموعة ثقافة الخلايا</td><td>Costar</td><td></td><td>Eyeball تثبيت</td></tr><tr><td>24 بئر لوحة التخثر</td><td>الدموي Labedit Company</td><td></td><td>حضانة الأجسام المضادة</td></tr><tr><td>شرائح مجهر التصاق</td><td>Citotest</td><td></td><td>أو ما شابه</td></tr><tr><td>ذلك من التبريد المضاد للفلورسنت</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td>إبطاء تبريد التألق</td></tr><tr><td>BSA (زلال مصل الأبقار)</td><td>Servicebio</td><td>GC305010</td><td>كاشف حجب</td></tr><tr><td>مجهر متحد البؤر</td><td>أوليمبوس</td><td></td><td>تطبيق عدسة موضوعية 40x</td></tr><tr><td>مقص منحني</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co.، Ltd.</td><td></td><td>أدوات تشريح</td></tr><tr><td>المجهر</td><td>RWD علوم الحياة المحدودة & nbsp ؛</td><td>77001S</td><td>أدوات تشريح</td></tr><tr><td>الملقط</td><td>جيانغسو Kanghua المعدات الطبية المحدودة</td><td></td><td>أدوات تشريح</td></tr><tr><td>الميثانول</td><td>Sinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة</td><td>20210624</td><td>GC>; 99.5٪</td></tr> <tr><td>طلاء الأظافر</td><td>SecheVite</td><td></td><td>عامل الختم</td></tr><tr><td>الإبر&nbsp;</td><td>شنغهاي تفضل بمجموعة تنمية الشركات المحدودة</td><td></td><td>تسريع التثبيت</td></tr><tr><td>محلول بارافورمالدهايد</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>تثبيت مقلة</td></tr><tr><td>العين PBS (الفوسفات المحلول الملحي المخزن درجة الحموضة 7.4)</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>شطف مقلة العين &nbsp;</td></tr><tr><td>الجسم المضاد الأساسي: بروتين خنزير غينيا المضاد للربط بالحمض النووي الريبي مع التضفير المتعدد (RBPMS)</td> <td>PhosphoSolutions</td><td>Cat. # 1832-RBPMS</td><td>للتألق المناعي. يستخدم في 1: 400</td></tr><tr><td>الجسم المضاد الثانوي: Cy3 affiniPure donkey المضاد لخنزير غينيا IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-165-148</td><td>للتألق المناعي. تستخدم في 1: 400</td></tr><tr><td>مقص مستقيم</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co.، Ltd.</td><td></td><td>أدوات التشريح</td></tr></tbody></table>

تحضير كامل قائم على الميثانول لفحص خلايا العقدة الشبكية

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

تنشر خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، وهي الخلايا العصبية الإسقاطية للشبكية ، المعلومات البصرية الخارجية إلى الدماغ. التغيرات المرضية في RGCs لها علاقة وثيقة مع العديد من الأمراض التنكسية في شبكية العين. كثيرا ما يستخدم التلطيخ المناعي الكامل للشبكية في الدراسات التجريبية على RGCs لتقييم الظروف التنموية والمرضية للشبكية. في ظل بعض الظروف ، قد تحتاج بعض عينات شبكية العين القيمة ، مثل تلك المأخوذة من الفئران المعدلة وراثيا ، إلى الاحتفاظ بها لفترة طويلة دون التأثير على مورفولوجيا أو عدد RGCs. للحصول على نتائج تجريبية موثوقة وقابلة للتكرار ، يعد استخدام وسيط حفظ فعال أمرا ضروريا. هنا ، نصف تأثير الميثانول كوسيط ثابت مساعد لمستحضرات شبكية العين الكاملة والتخزين طويل الأجل. باختصار ، أثناء عملية العزل ، يتم سحب الميثانول البارد (-20 درجة مئوية) على سطح الشبكية للمساعدة في إصلاح الأنسجة وتسهيل نفاذيتها ، ومن ثم يمكن تخزين شبكية العين في الميثانول البارد (-20 درجة مئوية) قبل أن تكون مناعية. يصف هذا البروتوكول سير عمل عزل الشبكية وبروتوكول تخزين عينات الأنسجة ، وهو أمر مفيد وعملي للتحقيق في RGCs.

بعد التشريح ، يجب أن تبدو شبكية العين مثل البرسيم المسطح المكون من أربع أوراق. في هذه الدراسة ، باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه ، تحولت شبكية العين إلى اللون الأبيض بعد إضافة الميثانول (الشكل 1). وفي الوقت نفسه ، تغيرت شبكية العين من لينة إلى مرنة ومسطحة. بعد ذلك ، تم تصنيف RGCs بمكافحة RBPMS8. تم التقاط أربعة حقول صور في شبكية العين الكاملة (ن = 3) باستخدام مجهر متحد البؤر (العدسة: 10x ؛ الهدف: 40x). يتم توضيح وجهات النظر التمثيلية ل RGCs المرئية لشبكية العين قبل مع...

يمكن استخدام الميثانول كوسيط ثابت مساعد لمستحضرات الشبكية الكاملة والتخزين طويل الأجل ، وهو أمر مفيد لفحص خلايا العقدة الشبكية.

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

يهدف البحث إلى توفير سير عمل معدل لعزل الشبكية وبروتوكول تخزين عينات الأنسجة ، وهو أمر مفيد وعملي للتحقيق في RGCs. شبكية العين هشة وقابلة للطي ، مما يحد من البحث التجريبي عند عمل رقعة شبكية كاملة. بالإضافة إلى ذلك ، لا تتطلب جميع شبكية العين صبغة مناعية فورية.في بعض الأحيان ، تحتاج عينات شبكية العين الإضافية إلى الحفظ لاستخدامها مرة أخرى. نحن نقدم وصفا تفصيليا لطريقة موثوقة ومباشرة تقنيا لصبغ شبكية العين الكامل الذي يؤكد على التحضير المناسب والحاجة إلى تخزين شبكية العين على المدى الطويل لفحص RGC. سنواصل العمل على البحث الأساسي لاعتلالات الأعصاب البصرية التنكسية.علاوة على ذلك ، سيتم استكشاف الآلية الجزيئية لإصابة العصب البصري وتجديد الحوادث والأهداف السريرية المحتملة لتشخيص وعلاج الأمراض التنكسية العصبية.

methanol-based-whole-mount-preparation-for-investigation-retinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

هذا المقال يقدم وصفا لكيفية تشريح وسجل من إعداد الشبكية معزولة في الماوس. على وجه الخصوص ، ونحن تصف كيفية تسجيل الاستجابات الضوء من السكان خلية عقدية fluorescently المسمى لاحقا ، وتحديد وتحليل مورفولوجيا والخمسين.

لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة

المصدر: Laboissonniere, et. al. تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لمجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية. J. Vis. Exp. (2017).   يوضح هذا الفيديو تقنية تتبع الفلورسنت لتحديد الأنواع الفرعية للخلايا العقدية الشبكية (RGC) في شبكية الفأر المعدلة وراثيا. تتضمن العملية تأمين شبكية العين المعزولة في غرفة التسجيل ، والحفاظ على صلاحية الخلية من خلال التروية المؤكسجة ، واستهداف RGCs المسمى بالفلورسنت باستخدام ماصة مع متتبع. من خلال تحليل التشكل الشجيري والتقسيم الطبقي ، تتيح الطريقة تصنيف...

تحديد الأنواع الفرعية لخلايا العقدة الشبكية للفأر من خلال تتبع الفلورسنت

يوضح هذا المقال فيديو مجموعة المتابعة، والإجراءات اللازمة لتصحيح أجسام الخلايا وكيفية تنفيذ تسجيلات المشبك الحيوية من خلايا العقدة في جبل لالجامع الماوس للشبكية. هذا الأسلوب يسمح التحقيق في مساهمة الدقيق للمدخلات متشابك مثير والمثبطة، وحجمها النسبي وتوقيت لالتشويك العصبية.

تنفيذ المشبك الحيوي مع المواصلة متشابك والاصطناعية في خلايا الشبكية العقدة ماوس

يوفر شبكية العين الفئران حديثي الولادة نموذجا الفسيولوجية تتميز كذلك من الأوعية الدموية، والذي يسمح التحقيقات عن دور الجينات المختلفة أو الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية...

كله جبل تلوين مناعي للشبكية الفأر حديثي الولادة المعنية بالتحقيق في الأوعية الدموية<em&gt; في الجسم الحي</em

البروتوكول الموصوف هنا مخصص للتقييم الهيكلي لإعداد الشبكية الكاملة. يتضمن ذلك أوصافا لتشريح الأنسجة ، والتركيب على غشاء متعدد تترافلورو إيثيلين مجفف بالماء (PTFE) ، وتحميل البلعة بعلامات الفلورسنت ، ومقارنة التثبيت مع الكربوديميد وبارافورمالديهايد للتحليل الكيميائي المناعي للمكونات الخلوية والمشبكية.

بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

وتستخدم بروتوكولات المناعية لدراسة توطين بروتين معين في شبكية العين. وتستخدم تقنيات التصوير الكالسيوم لدراسة ديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم.

طرق التصوير المناعى والكالسيوم في Wholemount الجرذ الشبكية

هنا، نقدم نهج كومبيناتوريال لتصنيف أنواع الخلايا العصبية قبل العزلة ولتوصيف لاحقة من ترانسكريبتومس أحادية الخلية. هذا البروتوكول يحسن إعداد عينات لنجاح تسلسل الحمض النووي الريبي (رنا-سيق) ويصف منهجية مصممة خصيصا لتعزيز فهم التنوع الخلوي.

خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-سيك من مجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية

يحدد هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية للفحص المجهري الإلكتروني المناعي قبل التضمين ، مع التركيز على استكشاف الدوائر المشبكية وتوطين البروتين في شبكية العين.

فحص دوائر الشبكية والتوطين الجزيئي عن طريق التضمين المسبق للمجهر الإلكتروني المناعي

يصف هذا البروتوكول إجراء عزل شبكية العين الفأرية بالكامل وإجراء التلوين المناعي لتسمية جميع خلايا العقدة الشبكية (RGCs). يتبع العملية التصوير والعد التلقائي ل RGCs باستخدام البرامج القائمة على الذكاء الاصطناعي ، مما يوفر طريقة بسيطة وسريعة ودقيقة لقياس RGCs في شبكية الفأر بأكملها.

تلطيخ مناعي كامل التثبيت والعد التلقائي لخلايا العقدة الشبكية للفأر

تظهر شبكية العين تنظيما مكانيا معقدا عبر هيكلها الرقائقي. تتطلب تقنيات النسخ المكاني والتسلسل المكانية الحديثة أقساما &lt; الأنسجة بسمك 20 ميكرومتر ، مما يحد من قابليتها لتطبيق أبحاث الشبكية. تنتج طريقة التقطيع بالتبريد المجمدة حديثا أقساما رقيقة من شبكية العين مع الحفاظ على العلاقات المكانية المستوية ، مما يتيح رسم خرائط جزيئية شاملة عبر الصفائح.

أون الوجه التقطيع بالتبريد لشبكية العين الفأرية للتحليل الجزيئي المكاني عالي الأبعاد

هنا ، نصف استخدام طريقة وضع العلامات على الفوسفاتيز القلوي الموجه وراثيا (AP) للتحقيق في السمات التشريحية والأنماط الظاهرية لشبكية الفئران تحت السمية المثيرة التي يسببها NMDA. بالاقتران مع العديد من خطوط المراسل الخاصة بالخلايا العقدية الشبكية (RGC) ، نكشف عن أنماط ظاهرية جديدة في RGCs المحتضرة طوال العملية التنكسية.

فحص السمات التشريحية للخلايا العقدية الشبكية تحت السمية المثيرة الناجمة عن حمض N-methyl-D-aspartic (NMDA)

تعلم طريقة تحضير كامل قائم على الميثانول لعزل وتحضير شبكية العين لدراسة خلايا العقدة الشبكية. تتيح هذه التقنية الحفظ طويل الأمد للعينات دون الحاجة إلى التصبيغ الفوري.

تحضير كامل قائم على الميثانول لفحص خلايا العقدة الشبكية

استكشف المزيد من الفيديوهات