Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

Zhaodi Jiang

doi:10.3791/65246

Journal

/

Biology

/

التوليف المباشر لجسيمات الذهب النانوية المرئية EM في الخلايا لتحليل توطين البروتين مع البنية التحتية المحفوظة جيدا

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

التوليف المباشر لجسيمات الذهب النانوية المرئية EM في الخلايا لتحليل توطين البروتين مع البنية التحتية المحفوظة جيدا

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

1,473 Views

•

09:22 min

•

April 28, 2023

DOI:

10.3791/65246-v

DOI:

10.3791/65246-v

•

09:22 min

April 28, 2023

•

1453 Views

Zhaodi Jiang^1,2

¹National Institute of Biological Sciences, Beijing ²Tsinghua Institute of Multidisciplinary Biomedical Research,Tsinghua University

Transcript

يعد اكتشاف البروتين وتوطينه أمرا ضروريا في البحث البيولوجي. يصف بروتوكولنا تقنية جديدة لوضع العلامات EM باستخدام علامات مشفرة وراثيا تسمح بتصور جزيء واحد في الموقع مع بنية فائقة محفوظة جيدا. من الأهمية بمكان تجنب الإفراط في التثبيت.

تعتمد طريقة وضع العلامات على نشاط cysteines في العلامات ، والتي هي حساسة للغاية للربط المتقاطع للألدهيد. يتجنب بروتوكولنا استخدام مثبتات الألدهيد ويحافظ على نشاط العلامة والبنية الفائقة. في نفس الوقت.

لطالما كان وضع العلامات EM يمثل تحديا ، حيث يعاني من ضعف التشكل أو وضع العلامات غير الفعالة. تقوم بروتوكولاتنا بتجميع الجسيمات النانوية في الموقع مباشرة على البروتينات الفردية لتوفير توطين واضح ودقيق للبروتينات المستهدفة ، مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية وكفاءة عالية ونوعية. لقد حققنا حتى الآن علامات ممتازة في البروتينات المعزولة وخلايا E.coli وخلايا الخميرة وخلايا HeLa.

سوف نستكشف ونحسن طريقة التطبيق على عينات الأنسجة. سيسمح لنا الجمع بين تقنيات cryo-FIB و cryo-EM السائدة بمعالجة الأسئلة البيولوجية المهمة.

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية لصق المجهر الإلكتروني القابل للاستنساخ للكشف عن البروتينات الموسومة بالميتالوثيونين في الخلايا باستخدام تقنية جديدة لتخليق الجسيمات النانوية الذهبية القائمة على آلية قمع النوى الذاتية.