Name: إثراء مكتبة mRNA و Bisulfite-mRNA للجيل التالي من التسلسل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: اكتشف دور مثيلة RNA وتحديداً 5-methylcytosine في سرطان البنكرياس باستخدام تقنية bisulfite RNA seq. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد RNAs الممثلة تفاضلياً المشاركة في تقدم الورم.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان. [NSTC 111-2314-B-006-003]

إنشاء مكتبات Bisulfite-mRNA قوية لرسم الخرائط على مستوى النسخ

<ol><li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2021+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).</li>
<li>Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+5-methylcytosine+%28m5C%29+RNA+Methyltransferases%3A+Mechanisms%2C+Cellular+Functions%2C+and+Links+to+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease.</a> Genes. 10 (2), 102(2019).</li>
<li>Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+methylation+in+plants%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">RNA methylation in plants: An overview.</a> Frontiers in Plant Science. 14, 1132959(2023).</li>
<li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomic+addition+of+m5C+to+HIV-1+transcripts+regulates+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression.</a> Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li>
<li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+landscape+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The RNA modification landscape in human disease.</a> RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li>
<li>Legrand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+robust+methylation+calling+for+whole-transcriptome+bisulfite+sequencing+reveals+distinct+methylation+patterns+for+mouse+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs.</a> Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).</li>
<li>Schaefer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+5-methylcytosine+analysis+by+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing.</a> Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly%28A%29+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1(2017).</li>
<li>Schumann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+links+between+5-methylcytosine+content+of+mRNA+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation.</a> BMC Biology. 18 (1), 40(2020).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methylcytosine+promotes+mRNA+export+-+NSUN2+as+the+methyltransferase+and+ALYREF+as+an+m5C+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader.</a> Cell Research. 27, 606(2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methylcytosine+promotes+pathogenesis+of+bladder+cancer+through+stabilizing+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+activity-associated+alteration+of+mRNA+m%285%29+C+methylation+in+CD4%28%2B%29+T+cells+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430(2020).</li>
<li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+roles+of+RNA+m5C+modification+and+its+implications+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy.</a> Biomarker Research. 10 (1), 15(2022).</li>
<li>Xue, C., Zhao, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RNA+cytosine-5+methylation%3A+detection%2C+regulatory+mechanisms%2C+biological+functions+and+links+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer.</a> Biomarker Research. 8 (1), 43(2020).</li>
<li>Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+RNA+modifications+in+the+epitranscriptome%3A+predict+and+validate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+mRNA+5-methylcytosine+modifications%3A+Detection%2C+effectors%2C+biological+functions%2C+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).</li>
<li>Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+RNA+Immunoprecipitation+Assay+to+Study+m5C+Modification+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231(2020).</li>
<li>Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protocols+for+the+illumina+genome+analyzer+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system.</a> Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).</li>
<li>Chen, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+bisulfite+sequencing+reveals+NSUN2-mediated+suppression+of+epithelial+differentiation+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer.</a> Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+5-hydroxylmethylcytosine+and+RNA+5-methycytosine+reprogramming+during+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNAs+as+targets+for+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation.</a> RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+NSUN2+deficiency+on+the+mRNA+5-methylcytosine+modification+and+gene+expression+profile+in+HEK293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells.</a> Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).</li>
<li>Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+mRNA+5-methylcytosine+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).</li>
<li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((meRanTK%3A+methylated+RNA+analysis+ToolKit%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li>
<li>Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+oligo-based+depletion+of+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12281(2019).</li>
<li>Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+of+5-methylcytidine+RNA+modifications+in+bacteria%2C+archaea%2C+and+yeast+reveals+m%285%29C+within+archaeal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs.</a> PLoS Genetics. 9 (5), e1003602(2013).</li>
<li>Furlan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+RNA+modification+detection+from+nanopore+direct+RNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data.</a> RNA Biology. 18, 31-40 (2021).</li>
<li>Leger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+modifications+detection+by+comparative+Nanopore+direct+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing.</a> Nature Communications. 12 (1), 7198(2021).</li>
<li>Mateos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+m6A+and+m5C+RNA+modifications+at+single-molecule+resolution+from+Nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+parameters+in+RNA+bisulfite+sequencing+data+generation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genomics+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis.</a> NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+calibration+of+epitranscriptomic+maps+using+a+synthetic+modification-free+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library.</a> Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).</li>
<li>Chao, H. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

في هذا البروتوكول ، تم تحقيق خط أنابيب مفصل لإثراء poly (A) ، وتحويل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة من خلال استخدام مكونات موحدة. قدم تحليل التسلسل الإضافي تحديد mRNA 5-methylcytosine في العينات ذات الأهمية.
الخطوة الحاسمة هي جودة بدء المواد - إجمالي الحمض النووي الريبي - لأن تدهور الحمض النووي الريبي سيؤثر على معدل استرداد تنقية poly (A) RNA. يجب التعامل مع العينة بعناية وتجنب تلوث RNase قبل إجراء خطوة تنقية poly (A) RNA. جزء آخر مهم من الإجراء هو عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل في إعد...

من بين أكثر من 150 نوعا من تعديلات ما بعد النسخ1 ، تم تحديد تعديل 5-methylcytosine (m5C) في أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي ، والحمض النووي الريبي المنقول ، والحمض النووي الريبي المرسال ، والحمض النووي الريبي الصغير ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ، والحمض النووي الريبي القبو ، والحمض النووي الريبي المحسن ، والحمض النووي الريبي الصغير الخاص بالجسم2. يرتبط الحمض النووي الريبي m 5 C بآليات بيولوجية ومرضية متنوعة مثل تنظيم نمو جذر النبات3 ، والتعبير الجيني الفيروسي4 ، وتطور السرطان5. الهدف من هذا البروتوكول هو توفير خطوط أنابيب مبسطة لتوصيف ملف تعديل mRNA m5C على نطاق النسخ للعينات البيولوجية في مراحل النمو المختلفة أو في بيئة المرض. تم تطوير تسلسل ثنائي الكبريتيت على نطاق النسخ لتوصيف المواضع ومستويات مثيلة السيتوزين الكمية في الحمض النووي الريبي المحول للكبريتيت عند دقة زوج القاعدة6،7،8،9. هذا مفيد بشكل خاص عند دراسة ارتباط m5C بالتعبير الجيني ومصير الحمض النووي الريبي الذي يشارك في الآليات التنظيمية البيولوجية في الخلايا. في خلية الثدييات ، هناك نوعان معروفان من قارئي m 5 C: يمكن ل ALYREF التعرف على m 5 C في النواة ويعمل كناقل mRNA من نواة إلى سيتوسول10 ، بينما يمكن ل YBX1 التعرف على m5C في السيتوبلازم وزيادة استقرار mRNA11. تم الإبلاغ عن انحراف m5C mRNAs المتعلقة بالمسارات المناعية في خلايا الذئبة الحمامية الجهازية CD4 + T12. كشفت الدراسات عن وجود علاقة بين تعديل mRNA m5C وتعديل مناعة السرطان وتطور السرطان13,14. ومن ثم، فإن رسم خريطة ملف تعريف تعديل m5C على mRNA يمكن أن يوفر معلومات حاسمة لتوضيح الآلية التنظيمية المحتملة.
للتحقيق في الأدوار الوظيفية لتعديل الحمض النوويالريبي m 5 C في ظل ظروف بيولوجية معينة ، يمكن دمج النهج القائمة على تحويل ثنائي الكبريتيت (bsRNA-seq) والنهج القائمة على إثراء تقارب الأجسام المضادة مثل m 5 C-RIP-seq و miCLIP-seq و 5-Aza-seq مع منصة التسلسل عالية الإنتاجية لتوفير الكشف الفعال عن المناطق والتسلسلات المستهدفة مع تعديلات m5C على مقياس واسع للنسخ15 ، 16. توفر ميزة هذا البروتوكول المشهد الشامل للحمض النووي الريبيm 5 C بدقة قاعدة واحدة لأن النهج القائم على إثراء تقارب الأجسام المضادة يعتمد على توافر أجسام مضادة عالية الجودة ويمكن أن يحقق دقة الجزء الواحد من مشهد مثيلة m5C17.
ستتم معالجة جميع عينات الحمض النووي الريبي بجولتين من إثراء mRNA باستخدام حبات oligo (dT) ، وثلاث دورات من تفاعل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد مكتبة التسلسل. لمراقبة جودة الحمض النووي الريبي ، سيتم فحص كل عينة من الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الشعري قبل وبعد إجراءات تنقية mRNA وتفاعل ثنائي الكبريتيت لتقييم توزيع الشظايا. سيتم فحص المكتبات المنقاة من خلال صفات amplicon PCR الخاصة بها ، وشظايا توزيع حجم الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الشعري ، وفحص كمياتها الإجمالية بواسطة المقايسات الكمية القائمة على الأصباغ الفلورية قبل التسلسل. يمكن أيضا استخدام النظام لتحليل مجموعة واسعة من العينات البيولوجية مثل المنتجات الزراعية ، والفيروسات المعزولة ، وخطوط الخلايا ، والكائنات الحية النموذجية ، والعينات المرضية.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 نظام التحليل الحيوي للرحلان الكهربائي</td><td>Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا</td><td></td><td>RNA الكشف عن جودة</td></tr><tr><td>حبات AMpure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>تنقية الحمض النووي</td></tr><tr><td>الحيوي محلل الحمض النووي طقم حساسية عالية</td><td>Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا</td><td>5067-4626</td><td>الكشف عن جودة الحمض النووي</td></tr><tr><td>المحلل الحيوي RNA 6000 طقم بيكو</td><td>Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا</td><td>5067-1513</td><td>RNA الكشف عن الجودة</td></tr><tr><td>DiaMag02 - الرف المغناطيسي</td><td>Diagenode ، Denville ، NJ</td><td>B04000001</td><td>مساعدة إعداد</td></tr><tr><td>المكتبة DiaMag1.5 - الرف المغناطيسي</td><td>Diagenode ، Denville ، NJ</td><td>B04000003</td><td>مساعدة poly (A) RNA purificaion</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT طقم تنقية</td><td>Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA</td><td>61011</td><td>poly (A) RNA purificaion ؛ Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>JTBaker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ RNA مثيلة</td><td>Kit Zymo ، Irvine ، CA</td><td>R5002</td><td>معالجة ثنائي الكبريتيت</td></tr><tr><td>Firefly luciferase mRNA</td><td>Promega ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>L4561</td><td>ارتفاع في التحكم seqeunce &amp;nbsp ؛</td></tr><tr><td>مجموعات القياس الكمي لمكتبة KAPA</td><td>روش ، سويسرا</td><td>مكتبة</td><td>KK4824</td></tr><tr><td>قياس الطيف الضوئي النانوي</td><td>Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA</td><td></td><td>إجمالي الكشف عن كمية الحمض النووي الريبي</td></tr><tr><td>NEBNext متعدد الإرسال Oligos ل illumina (مجموعة الفهرس التمهيدي 1)</td> نيو <td>إنجلاند بيولوجيس ، إبسويتش ، ماساتشوستس</td><td>إعداد</td><td></td></tr> <tr><td>مكتبة E7335SNEBNext Ultra <img alt="المعادلة 1" src="/files%20/%20ftp_upload/65352%20/%2065352eq01.jpg" style="الهامش: تلقائي ؛ "> مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي الاتجاهي ل Illumina</td><td>New England Biolabs ، إبسويتش ، MA</td><td>إعداد مكتبة E7760S</td><td></td></tr> خالية من <tr><td>Nuclease Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td>Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA</td><td>4641010</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorometer &amp;nbsp ؛</td><td>Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA</td><td></td><td>الكشف عن كمية الحمض النووي</td></tr> الريبي <tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA</td><td>Q32854</td><td>الكشف عن كمية الحمض</td></tr><tr><td>النووي Qubit RNA HS Assay</td><td>Kit Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA</td><td>Q32852</td><td>الكشف عن كمية الحمض النووي الريبي</td></tr></tbody></table>

إثراء مكتبة mrna و bisulfite-mrna للجيل التالي من التسلسل

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

ترتبط تعديلات ما بعد النسخ للحمض النووي الريبي في أنواع مختلفة من نسخ الحمض النووي الريبي بتنظيم الحمض النووي الريبي المتنوع في الخلايا حقيقية النواة. وقد تبين أن تعديلات الحمض النووي الريبي الشاذ 5-ميثيل سيتوزين والتعبير غير المنظم لميثيل ترانسفيراز الحمض النووي الريبي مرتبطة بأمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطانات. تم تطوير تسلسل ثنائي الكبريتيت على نطاق النسخ لتوصيف المواضع ومستويات مثيلة السيتوزين الكمية في الحمض النووي الريبي المحول ثنائي الكبريتيت عند دقة زوج القاعدة. هنا ، يعرض هذا البروتوكول إجراءات جولتين من تنقية poly (A) RNA ، وثلاث دورات من تفاعل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة بالتفصيل للسماح برسم خرائط على مستوى النسخ لمواقع تعديل mRNA 5-methylcytosine. يعد تقييم كمية وجودة الحمض النووي الريبي بعد التفاعل الرئيسي أمرا ضروريا لمراقبة سلامة الحمض النووي الريبي وهو خطوة حاسمة لضمان مكتبات تسلسل عالية الجودة. من الناحية المثالية ، يمكن إكمال الإجراءات في غضون ثلاثة أيام. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن أن يؤدي استخدام الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة كمدخل عمليا إلى بناء مكتبات ثنائية الكبريتيت-mRNA قوية لتسلسل الجيل التالي من عينة الاهتمام.

تم إنشاء سلسلة من مكتبات bsRNA-seq من خطوط الخلية19 باتباع الإجراءات الواردة في هذا التقرير (الشكل 1). بعد تنقية الحمض النووي الريبي الكلي مصحوبة بمعالجة DNase التي يتم إجراؤها على عينات خط الخلية وفحص الجودة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي وقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية (A260 / A280) ، يمكن لعينة الحمض النووي الريبي المضي قدما في إثراء poly (A) RNA. لتحديد ما إذا كان التنقية المزدوجة يمكن أن يزيل غالبية الحمض النووي الريبوزي الريبو...

يوفر هذا البروتوكول سير عمل سهل المتابعة لإجراء تنقية الحمض النووي الريبي poly (A) ، وتحويل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة باستخدام معدات موحدة لعينة بيولوجية ذات أهمية.

إثراء مكتبة mRNA و Bisulfite-mRNA للجيل التالي من التسلسل

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...

يهدف هذا البحث إلى دراسة دور مثيلة الحمض النووي الريبي ، وتحديدا تعديل 5-methylcytosine ، في سرطان البنكرياس. الأسئلة التي نريد الإجابة عليها هي كيف يؤثر التنظيم أو التقليل من تنظيم بعض ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي الريبي على الأنماط الظاهرية للخلايا السرطانية وأيضا ، من خلالها ركائز الحمض النووي الريبي. توفر هذه الدراسة المناظر الطبيعية الشاملة للحمض النووي الريبي m5C بدقة قاعدة واحدة مع معدات موحدة.من هذه الدراسة باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي ثنائي الكبريتيت ، تربط النتائج ارتباط تعديل الحمض النووي الريبي m5C مع ضعف تمايز الخلايا السرطانية. هذا من شأنه أن يمهد الطريق للدراسات المستقبلية في تمييز الركاب مقابل تأثيرات سائق المرض ل m5C المحدد في نسخ الحمض النووي الريبي. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا تحديد مجموعة الحمض النووي الريبي الميثيلي التفاضلي الذي قد يشارك في تطور الورم.علاوة على ذلك ، يمكن أن توفر تجارب قاعدة الجزيء الواحد دورا تنظيميا أكثر تفصيلا ل RNA m5C المحدد.

enrichment-mrna-bisulfite-mrna-library-preparation-for-next

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن هنا وصف طريقة لتحضير كل واحد المكتبات نهاية القراءة ومرنا ، المقترنة تسلسل البورشيد التسلسل الجيني للتحليل بناء على تضخيم الحمض النووي الريبي T7 الخطية. هذا البروتوكول لا يتطلب سوى 10 نانوجرام من الحمض النووي الريبي ابتداء مجموع المكتبات ويولد متسقة للغاية تمثل النصوص كلها.

قراءة واحدة المقترنة مكتبات نهاية البورشيد مرنا ، في الفترة من 10 نانوجرام تسلسل الحمض النووي الريبي مجموع

ويرد تبسيط العمل لدراسة الحامض النووي والتغيرات في التعبير الجيني في وقت مبكر على الحياة التوتر. بدءا من فصل الأمهات من الفئران حديثي الولادة والعزلة من أنسجة المخ المنفصلة، ​​التي نمثلها بروتوكول لعزل في وقت واحد DNA و RNA من اللكمات أنسجة المخ لتسلسل بيسلفيت اللاحقة وتحليل RT-PCR.

الأمثل تحليل الحامض النووي والتعبير الجيني من المناطق، الصغيرة تشريحيا المعرفة من الدماغ

MicroRNAs (miRNAs) هي فئة محفوظة على نطاق واسع من الجزيئات التنظيمية. نصف هنا طريقة استنساخ miRNA التي تعتمد على خطوتين قويتين للربط متبوعة بتسلسل عالي الإنتاجية. تسمح طريقتنا بالقياس الكمي الدقيق على مستوى الجينوم ل miRNAs.

ربط ذات كفاءة عالية من الحمض النووي الريبي الجزيئات الصغيرة لالرنا الميكروي الكميات من قبل التسلسل الإنتاجية العالية

تسلسل ثنائي الكبريتيت المنخفض المعزز هو طريقة لإعداد مكتبات التسلسل لتحليل مثيلة الحمض النووي بناء على هضم إنزيم التقييد جنبا إلى جنب مع تحويل ثنائي كبريتيت السيتوزين. يتطلب هذا البروتوكول 50 نانوغرام من المواد الأولية وينتج بيانات دقة زوج أساسي في المناطق الجينومية الغنية ب GC.

المحسن انخفاض التمثيل بيسلفيت تسلسل لتقييم الحامض النووي في قرار قاعدة زوج

تسلسل أمبليكون ثنائي الكبريت (BSAS) هو طريقة لقياس مثيلة السيتوزين في المناطق الجينومية المستهدفة ذات الأهمية. تستخدم هذه الطريقة تحويل ثنائي الكبريتيت مقترنا بتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للمناطق المستهدفة قبل تسلسل الجيل التالي لإنتاج الكمية المطلقة لمثيلة الحمض النووي على مستوى أساسي محدد.

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

ويصف هذا البروتوكول طريقة لرسم الخرائط مرناً قبل 3 ' نهاية تجهيز المواقع.

3 ' نهاية تسلسل إعداد مكتبة مع A-seq2

هنا، يمكننا وصف البروتوكول وتنفيذ الميثيل-Seq، منصة ابيجينوميك، باستخدام نموذج الفئران لتحديد تغييرات جينية المرتبطة بالتعرض للإجهاد المزمن. النتائج تبين أن منصة Seq الميثيل الفئران قادرة على اكتشاف الاختلافات مثلايشن التي تنشأ من التعرض للإجهاد في الفئران.

منصة Seq الميثيل الفئران لتحديد تغييرات جينية المرتبطة بالتعرض للإجهاد

نقدم بروتوكول تعويض مكتبة RNA صغيرة مفصلة مع تحيز أقل من الأساليب القياسية وزيادة الحساسية لRNAs 2'-O-methyl. ويمكن اتباع هذا البروتوكول باستخدام الكواشف محلية الصنع لتوفير التكلفة أو استخدام مجموعات للراحة.

تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من RNAs 2'-O-Methyl

هنا نحن نصف مراحل جمع العينات وإعداد لريبو-seq في البكتيريا. ويؤدي تسلسل المكتبات المعدة وفقا لهذه المبادئ التوجيهية إلى بيانات كافية لإجراء تحليل معلوماتي حيوي شامل. البروتوكول الذي نقدمه بسيط، ويستخدم معدات مختبرية قياسية ويستغرق سبعة أيام من التحلل إلى الحصول على المكتبات.

RIBO-seq في البكتيريا: مجموعة عينة وبروتوكول إعداد المكتبة لتسلسل NGS

هنا ، نقدم بروتوكولا للاختيار المختبري لمثبطات النسخ الهندسية (ETRs) ذات كفاءة إسكات عالية وطويلة الأجل ومستقرة وعلى الهدف ونشاط منخفض على مستوى الجينوم وخارج الهدف. يسمح سير العمل هذا بتقليل ذخيرة أولية معقدة من ETRs المرشحة إلى قائمة قصيرة ، مناسبة لمزيد من التقييم في الإعدادات ذات الصلة بالعلاج.

في المختبر اختيار مثبطات النسخ المهندسة لإسكات الجينات اللاجينية المستهدفة

اكتشف دور مثيلة RNA وتحديداً 5-methylcytosine في سرطان البنكرياس باستخدام تقنية bisulfite RNA seq. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد RNAs الممثلة تفاضلياً المشاركة في تقدم الورم.

إثراء مكتبة mRNA و Bisulfite-mRNA للجيل التالي من التسلسل

استكشف المزيد من الفيديوهات