زرع الطعوم تحت الشبكية الموجهة عبر الحدقة في نموذج فأر تنكس الشبكية
January 26th, 2024
يقدم هذا البروتوكول نهجا عبر الصلبة موجها بالرؤية عبر الحدقة لتقديم الطعوم الخلوية تحت الشبكية بأمان ودقة ، مع معدل منخفض من المضاعفات الجراحية ، في متلقي الفئران مع أو بدون تنكس الشبكية.
الهدف العام من هذه الدراسة هو تطوير منصة زرع عبر الصلبة مع توجيه مباشر عبر الحدقة لتسهيل توصيل الخلايا تحت الشبكية في متلقي الفئران. تم إجراء جميع التجارب على وفقا لدليل المعهد الوطني للصحة. بياننا عن استخدام ووافقت عليه لجنة رعاية واستخدام بجامعة جونز هوبكنز.
تم استخدام اعتماد عمر الفئران EGFP في يوم ما بعد الولادة 3-6 كمتبرعين بمعلقات خلايا الشبكية. تم اعتماد الفئران OPN1LW-EGFP / NRL ، العمر في اليوم 3 بعد الولادة كمتبرعين بورقة الشبكية. تم استخدام الفئران التنكس الشبكي البالغ Rd1 / NS مع نقص المناعة كمتلقين.
القتل الرحيم للفئران المانحة بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون. لعزل مقل عيون الفئران ، افتح جفون الجراء بعناية باستخدام مقص صغير وفضح مقلة العين. لف العصب البصري ، واسحب مقلة العين بالملقط الناعم.
بمجرد عزل مقل العيون ، قم بشق ثقب في وسط القرنية باستخدام إبرة قياس 25. قطع القرنية إلى النصف من خلال الحفرة. وتكبير الشق إلى الصلبة و RPE.
ثم قم بإزالة الصلبة و RPE. بعد ذلك ، استخدم ملقط ذو أسنان دقيقة لإزالة العدسة برفق والجسم الزجاجي لعزل الشبكية العصبية. لجمع معلق الشبكية المتبرع ، احتضان الشبكية العصبية في محلول غراء عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة حتى لا يتم اكتشاف كتل خلوية.
اجمع الخلايا المفردة باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة Papain. لتحضير ورقة الشبكية ، ضع الشبكية المعزولة في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. ثم قطع الشبكية العصبية برفق إلى صفائح شبكية متعددة بمقص صغير.
تخدير الفئران المتلقية بحقن الكيتامين والزيلازين داخل الصفاق. تأكد من أن مستوى التخدير الذي تحقق هو المستوى الجراحي حيث يفقد وميض وردود فعل الألم ، ولكن التنفس والتنفس يبقى منتظما. قم بتقييم عمق التخدير عن طريق قرصة الذيل أو ردود فعل سحب الدواسة.
أعد فحص عمق التخدير أثناء إجراء العملية. احتفظ بالفئران على طاولة الجراحة التي تم تسخينها مسبقا لتجنب انخفاض حرارة الجسم. تمدد التلاميذ المتلقيين مع قطرات العين تروبيكاميد قبل خمس دقائق من الجراحة.
يمكن للتلميذ المتوسع جيدا تسهيل التصور عبر الحدقة تحت مجهر التشغيل. ضع قطرة من بروباراكايين هيدروكلوريد على عين الفئران للتسكين. تطهير عين الفأر العملية وأنسجة العين المحيطة باليود.
ثم تنظيف العين مع برنامج تلفزيوني معقمة. اختراق النفق المحيطي في الغرفة الداخلية لتقليل ضغط العين. بعد ذلك ، ضع قطرة من هيالورونات الصوديوم وغطاء زجاجي فوق القرنية.
التصور عبر الحدقة لقاع الفأر متاح الآن تحت النطاق الجراحي. كشف موضع الحقن عن طريق دفع جدار العين نحو مركز الرؤية عبر الحدقة باستخدام ملقط مسنن. ثم اخترق الصلبة جزئيا بإبرة حقن مجهرية ، تواجه 90 درجة إلى جدار العين.
يمكن أن تكون الأوعية الشبكية السطحية بمثابة مرجع تشريحي لتحديد موقع الإبرة داخل الفضاء تحت الشبكية. ثم حقن ترقيع الشبكية. يمكن أن تسهل الفقاعات الصغيرة المحملة مسبقا في المحقنة التحقق من صحة الموقع تحت الشبكية للخلايا المانحة.
إذا أصبحت القرنية غائمة ، احتفظ بالإبرة في الفضاء تحت الشبكية ، حتى تصبح القرنية شفافة لتطبيع ضغط العين. أمسك حافة فتحة الحقن واسحب الإبرة بسرعة. معيار التسليم الناجح لتعليق الخلية هو فقاعة ثابتة في الفضاء تحت الشبكية.
التسليم الناجح لورقة الشبكية ، مقتنع بورقة بيضاء مرئية. احتفظ بالفئران المزروعة في قفص تعافي نظيف تم تسخينه مسبقا ، وراقبها بعناية بحثا عن أي علامات استغاثة. في حالة حدوث ذلك ، ضع قطرة من هيدروكلوريد البروباراكايين الموضعي على العين الجراحية مرتين أو ثلاث مرات.
قم بإزالة الفئران مرة أخرى إلى قفص المنزل بعد أن تكون الفئران في حالة تأهب تام ومتحركة. ضع عددا صغيرا من كريات الطعام في كوب الهلام على أرضية القفص. إذا واجهت الفئران مشكلة في الوصول إلى قادوس الطعام.
بعد شهرين من الزرع ، تم إجراء تنظير العين بالليزر للمسح متعدد الوسائط للتحقق من حالات ترقيع الشبكية التي شوهدت في الجسم الحي. أظهر التصوير المقطعي للتماسك البصري للمجال الطيفي أن ترقيع الشبكية نجا في الفضاء تحت الشبكية ويعيد تشكيل الطبقة النووية الخارجية لجميع الفئران المتلقية. لم يكتشف التصوير بالأشعة تحت الحمراء أي إعتام عدسة العين واضح في جميع الفئران المزروعة.
تم اكتشاف مضاعفات جراحية أخرى ، بما في ذلك النزيف ، بشكل سيء في الفئران المزروعة عن طريق التصوير العاكس متعدد الألوان. أظهر التلوين النسيجي مستقبلات ضوئية مخروطية وفيرة تعبر عن OPN1LW: EGFP و S-opsin في صفائح الشبكية المزروعة. وبالمثل ، أظهرت معلقات خلايا الشبكية المزروعة نسبة كبيرة من المستقبلات الضوئية الإيجابية المستعادة في الجسم الحي ، بما في ذلك العديد من قضبان EGFP الإيجابية الناضجة.
أظهرت الفئران غير المزروعة انحطاطا شديدا للطبقة النووية الخارجية مع مستقبلات ضوئية مخروطية متفرقة تعبر عن الانتعاش. ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن أي إشارة EGP في الفئران غير المزروعة. توفر هذه الدراسة منصة جراحية عبر الصلبة مع توجيه مباشر للرؤية عبر الحدقة لزراعة تحت الشبكية في متلقي الفئران.
تتيح هذه المنصة التسليم الدقيق للجرعات المعروفة من الخلايا. من السهل نسبيا تعلم وتسهيل الولادة تحت الشبكية بالإضافة إلى الحقن داخل الشبكية أو داخل الجسم الزجاجي لأنواع مختلفة من العوامل العلاجية ، بما في ذلك العلاج الجيني.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة نهجًا بصريًا موجهًا عبر الحدقة وعبر الصلبة لتوصيل الطعوم الخلوية تحت الشبكية في نماذج الفئران، مع تحقيق معدل منخفض من المضاعفات الجراحية. تستخدم الطريقة نظام توجيه مباشر عبر الحدقة لتحسين الدقة الجراحية لزراعة الخلايا تحت الشبكية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- طب العيون
- زراعة الخلايا
الخلفية
- زراعة الخلايا تحت الشبكية حاسمة في علاج تنكس الشبكية.
- قد تشكل الطرق الحالية مخاطر ومضاعفات.
- يوفر التوجيه عبر الحدقة تحسنًا محتملًا في الدقة.
- تعمل مجموعات من الفئران المصابة بتنكّس الشبكية كمواضيع تجريبية.
غرض الدراسة
- تطوير منصة جراحية لتوصيل الخلايا تحت الشبكية بأمان في الفئران.
- تقليل المضاعفات أثناء إجراءات زراعة الشبكية.
- التحقق من فعالية الطعوم في استعادة وظيفة الشبكية.
الطرق المستخدمة
- تضمنت المنصة التصور عبر الحدقة لتوصيل الخلايا تحت الشبكية.
- خدمت الفئران المصابة بتنكّس الشبكية كمستقبلات للطعوم الخلوية.
- تضمنت الخطوات الرئيسية عزل خلايا الشبكية المانحة، وإعداد موقع الجراحة، وإدارة التخدير.
- تم إجراء مراقبة للطعوم من خلال تقنيات التصوير بعد الجراحة.
النتائج الرئيسية
- تم تأكيد نجاح توصيل الطعوم بوجود بثور في الفضاء تحت الشبكي.
- أظهرت طبقات الشبكية بقاءً وتكاملًا في الشبكية المضيفة.
- كشف التحليل النسيجي عن وفرة الخلايا المستقبلة للضوء في الأنسجة المزروعة.
- نجحت الطعوم في إعادة تكوين الطبقة النووية الخارجية للشبكية المستقبلة بشكل فعال.
الاستنتاجات
- يمكن لنهج عبر الصلبة توصيل الخلايا تحت الشبكية بدقة وأمان.
- قد يسهل هذا الأسلوب التقدم في التطبيقات العلاجية، بما في ذلك العلاج الجيني.
- تشير النتائج إلى إمكانية التطبيقات الأوسع في علاج أمراض تنكس الشبكية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Precision subretinal delivery of cellular grafts in small animal models is a critical bottleneck for translational retinal therapy research. The transpupillary-guided trans-scleral transplantation platform enables reproducible, minimally traumatic graft placement, supporting robust preclinical evaluation of cell and gene therapies for retinal degeneration. This capability strengthens predictive confidence at the discovery-to-preclinical inflection point for ocular regenerative strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous testing of therapeutic hypotheses in disease-relevant retinal degeneration models.
- Supports functional validation of photoreceptor and RPE cell replacement strategies.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing precise localization and survival assessment of grafts.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized surgical workflow for reproducible subretinal delivery in high-throughput studies.
- Enables quantitative assessment of graft survival and integration using multimodal imaging.
- Supports assay development for evaluating cell viability and maturation post-transplantation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational continuity from discovery to preclinical validation.
- Enables longitudinal monitoring of graft maturation and integration, informing risk-adjusted advancement.
- Supports evaluation of intraocular delivery platforms for gene and cell therapies in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
This platform integrates into the discovery-to-preclinical continuum for ocular therapeutics, bridging early mechanistic studies and translational validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in retinal degeneration models.
- Screening: Standardizes subretinal delivery for reproducible, quantitative readouts across studies.
- Analytics: Enables imaging-based assessment of graft localization, survival, and maturation.
- Translational Research: Provides continuity for evaluating cell and gene therapies in relevant in vivo systems.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable surgical and imaging platform for diverse intraocular therapeutic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in retinal therapy development.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible subretinal transplantation procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust preclinical data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell and gene therapy candidates for retinal diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques and small animal anesthesia.
- Needs access to high-resolution imaging platforms for post-transplantation assessment.
- Demands cross-team standardization of surgical and analytical protocols.
- Adaptation may be needed for different donor cell types or disease models.
- Limited by the anatomical constraints of small animal eyes and may require further validation for human translation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:31
Animals
0:58
Collect Neural Retina
1:58
Prepare Donor Retinal Suspension
2:19
Prepare Donor Retinal Sheets
2:36
Prepare Mouse Recipients
3:46
Subretinal Transplantation of Retinal Grafts
5:12
Post-surgery Administration
5:48
Results
7:04
Conclusion
