A Validatable Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Adeno-Associated Viral Vectors in Bioshedding Studies of Tears

Bryanna Longacre; Amanda Souaysene; Carrie A. Vyhlidal; Matthew R. Pennington

doi:10.3791/65495

مقايسة تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي للقطرات القابلة للتحقق من صحتها للكشف عن النواقل الفيروسية ا...

JoVE Journal
Biology

This content is Free Access.

JoVE Journal Biology

A Validatable Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Adeno-Associated Viral Vectors in Bioshedding Studies of Tears

مقايسة تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي للقطرات القابلة للتحقق من صحتها للكشف عن النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي في دراسات الدموع البيولوجية

Full Text

2,843 Views

07:43 min

July 14, 2023

DOI: 10.3791/65495-v

Bryanna Longacre¹, Amanda Souaysene¹, Carrie A. Vyhlidal¹, Matthew R. Pennington¹

¹Cell and Gene Therapy,KCAS Bioanalytical and Biomarker Services

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for the detection and quantification of adeno-associated viral vectors (AAV) in human tears using droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR). It addresses significant regulatory gaps in laboratory practices for molecular studies and aims to provide a reliable framework for clinical applications.

Key Study Components

Research Area

Gene therapy vectors
Viral vector detection
Clinical trial assays

Background

Current regulatory gaps in biosafety evaluation
Challenges of detecting rare viral events in complex samples
Importance of accurate quantification in clinical samples

Methods Used

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR)
Adeno-associated viral vectors (AAV)
Sample validation processes without specific DNA extraction

Main Results

Achieved intra-assay precision of 3.7% at high spike level and 12.2% at low level
Established accuracy metrics for different QC levels
Demonstrated robustness for potential application in various viral shedding studies

Conclusions

This study showcases a validated ddPCR protocol suitable for regulatory studies of viral vectors in clinical settings.
It contributes significantly to the field of gene therapy and molecular diagnostics.

Frequently Asked Questions

What is ddPCR?

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive method for quantifying DNA without the need for a standard curve.

Why is accurate detection of AAV important?

Accurate detection is crucial for assessing the performance and safety of gene therapy interventions.

What challenges do complex matrices present in viral vector studies?

PCR interference and the presence of inhibitors can significantly affect the accuracy of quantification in complex samples like tears.

Can this protocol be applied to other viral vectors?

Yes, the framework developed here is adaptable for various viral vector shedding studies beyond AAV in human tears.

What are good laboratory practices?

Good laboratory practices are a set of principles intended to ensure the quality and integrity of laboratory studies and results.

How does this method improve assay validation?

By streamlining the validation process and eliminating specific DNA extraction steps, this method enhances reproducibility and efficiency.

هنا ، نقدم بروتوكولا لتطوير الممارسات المختبرية الجيدة والتحقق من صحتها في الكشف المتوافق عن النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي في الدموع البشرية عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي لدعم التطوير السريري لنواقل العلاج الجيني.

يحدد بروتوكولنا النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي في المصفوفات المعقدة. يعد الكشف الدقيق والقياس الكمي ضروريين لتقييم أدائها في التجارب السريرية. يسعى هذا البروتوكول على وجه التحديد إلى سد الثغرات التنظيمية الحالية في تصميم الدراسات الجزيئية المتوافقة مع الممارسات المختبرية الجيدة.

كجزء من تطوير النواقل الفيروسية ، تتطلب الوكالات التنظيمية تقييم التساقط الحيوي للنواقل الحيوية. ddPCR هي تقنية واعدة لهذا التقييم لأنها تسمح بالقياس الكمي الدقيق دون استخدام منحنى قياسي وحساسية محسنة مقارنة ب qPCR. قد يكون من الصعب التحقق من صحة القياس الكمي الدقيق في المصفوفات المعقدة التي تمت مواجهتها في البيئات السريرية ، مثل التمزقات ، بسبب تداخل تفاعل البوليميراز المتسلسل وتثبيطه.

يمكن أن تحد كميات العينات السريرية المحدودة أيضا من القدرة على اكتشاف الأحداث النادرة إذا لم يكن الفحص حساسا بدرجة كافية. يطور نهجنا إطارا قائما على ddPCR قابلا للتكرار وقابل للتكيف للتحقق من صحة المقايسات لاستخدامها في الدراسات المنظمة. تتجنب هذه الطريقة خطوة محددة لاستخراج الحمض النووي ، مما يسمح بالتحقق من الصحة بشكل أكثر بساطة وتوفر معايير واضحة لتقييم أداء الفحص لضمان المتانة والتكرار.

هذا البروتوكول لديه القدرة على تطبيقه على أي دراسة لتساقط النواقل الفيروسية ، وليس فقط اكتشاف AAV في الدموع ، كما هو موضح هنا. إنه يخلق إطارا قويا وقابلا للتكرار يمكن من خلاله تطوير العديد من البرامج المنظمة المناسبة للغرض.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos