Name: طرق تضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية على نطاق واسع (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: اكتشف بروتوكولات تضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية باستخدام مستخلصات E. coli. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من تطوير أجهزة تشخيصية جديدة تعمل خارج المختبر.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يقر المؤلفون تقديرا كبيرا بدعم جوائز مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية BB / V017551 / 1 (S.K. ، T.P.H.) و BB / W01095X / 1 (A.L. ، T.P.H.) ، ومجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية - جائزة مختبرات علوم وتكنولوجيا الدفاع EP / N026683 / 1 (C.J.W. ، A.M.B. ، T.P.H.). البيانات التي تدعم هذا المنشور متاحة علنا على: 10.25405/data.ncl.22232452. لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص المشاع الإبداعي (CC BY) على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف ناشئة.

تضمين تفاعلات CFPS في مجموعة متنوعة من مصفوفات الهيدروجيل

<ol><li>Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Engineering+in+an+open+world%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+System+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world.</a> Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).</li>
<li>Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Engineering+beyond+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853(2016).</li>
<li>Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+enabled+rapid+prototyping+for+metabolic+engineering+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+System+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology.</a> Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).</li>
<li>Kopniczky, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+as+a+prototyping+platform+for+mammalian+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).</li>
<li>Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+cell-free+biosensors+to+monitor+enzymatic+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).</li>
<li>Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+potential+of+cell-free+protein+synthesis+for+extending+the+abilities+of+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248(2019).</li>
<li>Focke, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+in+vitro+folding+with+cell+free+protein+synthesis+for+membrane+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression.</a> Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).</li>
<li>Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+synthesis+of+complex+biomolecular+assemblies%3A+wheat+germ+cell-free+protein+expression+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958(2021).</li>
<li>Bashir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+concepts+of+hydrogels%3A+synthesis%2C+properties%2C+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications.</a> Polymers. 12 (11), 2702(2020).</li>
<li>Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+hydrogels-A+promising+platform+in+enhancing+water+security+for+a+sustainable+future%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Material+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future.</a> Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580(2021).</li>
<li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis in hydrogel materials.</a> Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).</li>
<li>Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+strategies+for+adhesive+hydrogels+with+natural+antibacterial+agents+as+wound+dressings%3A+Status+and+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends.</a> Materials Today Bio. 15, 100429(2022).</li>
<li>Musgrave, C. S. A., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+lens+materials%3A+A+materials+science+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Contact lens materials: A materials science perspective.</a> Materials. 12 (2), 261(2019).</li>
<li>Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+hydrogel+from+baby+diaper+wastes+and+its+application+for+enhancing+soil+irrigation+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Management%22%5BJournal%5D)">Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management.</a> Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).</li>
<li>Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+drug+delivery+systems%3A+A+review+of+current+characterization+and+evaluation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1188(2020).</li>
<li>Jacob, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+hydrogels+in+drug+delivery+systems%2C+tissue+engineering+and+wound+management%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management.</a> Pharmaceutics. 3 (3), 357(2021).</li>
<li>Senapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7(2018).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biocompatible%2C+stimuli-responsive%2C+and+injectable+hydrogel+with+triple+dynamic+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds.</a> Molecules. 25 (13), 3050(2020).</li>
<li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactuators+based+on+stimulus-responsive+hydrogels+and+their+emerging+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22NPG+Asia+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications.</a> NPG Asia Materials. 11, 64(2019).</li>
<li>Fan, M., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+conjugation+for+biodegradable+hydrogels+as+drug+and+cell+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Cogent+Engineering%22%5BJournal%5D)">Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds.</a> Cogent Engineering. 7 (1), 1736407(2020).</li>
<li>Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+expression+and+in+situ+immobilization+of+proteins+for+generation+of+three-dimensional+protein+arrays+in+a+hydrogel+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix.</a> Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).</li>
<li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles%3A+Towards+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li>
<li>Huang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiobitsTM+explorer%3A+A+modular+synthetic+biology+education+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit.</a> Science Advances. 4 (8), 5105(2018).</li>
<li>Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+analysis+of+agarose-based+biopolymers+with+potential+use+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Proceeding%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine.</a> Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).</li>
<li>Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+on+recent+progress+of+the+hydrogels%3A+from+material+resources%2C+properties+to+functional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications.</a> Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785(2022).</li>
<li>Salati, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose-based+biomaterials%3A+Opportunities+and+challenges+in+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering.</a> Polymers. 12 (5), 1150(2020).</li>
<li>Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+Synthetic+compartments+with+life-like+functionality+and+adaptivity%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).</li>
<li>Kahn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+microgels+as+a+platform+for+cell-free+protein+expression+and+display%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transcription+and+translation+in+clay+hydrogel+and+implications+for+early+life+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution.</a> Scientific Reports. 3, 3165(2013).</li>
<li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles%3A+Towards+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li>
<li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+genetic+devices+confer+autonomic+and+adaptive+properties+to+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
<li>Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+DNA+hydrogel%3A+Design%2C+synthesis+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications.</a> Progress in Polymer Science. 98, 101163(2019).</li>
<li>Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+T+%222020+Chemical+Communications%22">2020 Chemical Communications</a>. , Newcastle University. UK. (2020).</li>
<li>Banks, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+reaction+components+affect+the+kinetics+and+performance+robustness+of+cell-free+protein+synthesis+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli-based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Moore, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoFlex%3A+A+multifunctional+MoClo+kit+for+E.+coli+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).</li>
<li>Benítez-Mateos, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+%C2%B5-channels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).</li>
</ol>

فيما يلي بروتوكولان لدمج تفاعلات CFPS القائمة على تحلل خلايا الإشريكية القولونية في الهلاميات المائية للأغاروز. تسمح هذه الطرق بالتعبير الجيني المتزامن في جميع أنحاء المادة. يمكن تكييف البروتوكول مع أنظمة CFPS الأخرى وقد تم إجراؤه بنجاح باستخدام مجموعات CFPS المتاحة تجاريا بالإضافة إلى محللات الخلايا المعدة في المختبر والمفصلة هنا. الأهم من ذلك ، أن البروتوكول يسمح بالتعبير الجيني في حالة عدم وجود مرحلة سائلة خارجية. هذا يعني أن النظام قائم بذاته ولا يتطلب حمام تفاعل خال من الخلايا. بخلاف الطرق السابقة التي حدثت...

تدمج البيولوجيا التركيبية تخصصات هندسية متنوعة لتصميم وهندسة الأجزاء والأجهزة والأنظمة القائمة على أساس بيولوجي والتي يمكنها أداء وظائف غير موجودة في الطبيعة. لا تزال معظم مناهج البيولوجيا التركيبية مرتبطة بالخلايا الحية. على النقيض من ذلك ، تسهل أنظمة البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا مستويات غير مسبوقة من التحكم والحرية في التصميم ، مما يتيح زيادة المرونة وتقصير الوقت لهندسة الأنظمة البيولوجية مع القضاء على العديد من قيود طرق التعبير الجيني التقليدية القائمة على الخلايا1،2،3. يتم استخدام CFPS في عدد متزايد من التطبيقات عبر العديد من التخصصات ، بما في ذلك بناء الخلايا الاصطناعية ، والنماذج الأولية للدوائر الجينية ، وتطوير أجهزة الاستشعار الحيوية ، وإنتاج المستقلبات4،5،6. كان CFPS مفيدا أيضا بشكل خاص لإنتاج البروتينات المؤتلفة التي لا يمكن التعبير عنها بسهولة في الخلايا الحية ، مثل البروتينات المعرضة للتجميع والبروتينات عبر الغشاء والبروتينات السامة6،7،8.
عادة ما يتم تنفيذ CFPS في التفاعلات السائلة. ومع ذلك ، قد يحد هذا من نشرها في بعض الحالات ، حيث يجب احتواء أي جهاز خال من الخلايا السائلة داخل وعاء تفاعل. كان الأساس المنطقي لتطوير الأساليب المعروضة هنا هو توفير بروتوكولات قوية لدمج أجهزة البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية ، ليس كمنصة لإنتاج البروتين في حد ذاتها ، ولكن بدلا من ذلك ، للسماح باستخدام الهلاميات المائية كهيكل مادي لنشر الأجهزة الخالية من الخلايا خارج المختبر. استخدام الهلاميات المائية كهيكل CFPS له العديد من المزايا. الهلاميات المائية هي مواد بوليمرية ، على الرغم من ارتفاع نسبة الماء (التي تزيد أحيانا عن 98٪) ، إلا أنها تمتلك خصائص صلبة9،10،11. لها استخدامات كمعاجين ومواد تشحيم ومواد لاصقة وهي موجودة في منتجات متنوعة مثل العدسات اللاصقة وضمادات الجروح والأشرطة اللاصقة البحرية ومحسنات التربة وحفاضات الأطفال9،11،12،13،14. الهلاميات المائية هي أيضا قيد التحقيق النشط كمركبات توصيل المخدرات9،15،16،17. قد تكون الهلاميات المائية أيضا متوافقة حيويا وقابلة للتحلل البيولوجي وتمتلك بعض استجابات المحفزات الخاصة بها9،18،19،20. لذلك ، فإن الهدف هنا هو خلق تآزر بين الوظائف المشتقة من البيولوجيا الجزيئية وعلوم المواد. تحقيقا لهذه الغاية ، بذلت جهود لدمج البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا مع مجموعة من المواد ، بما في ذلك الكولاجين ، اللابونيت ، بولي أكريلاميد ، الفيبرين ، ببتيد PEG ، والأغاروز 11،21،22 ، وكذلك لتغطية أسطح الزجاج والورق والقماش11،23،24 مع أجهزة CFPS. توضح البروتوكولات المعروضة هنا طريقتين لتضمين تفاعلات CFPS في مصفوفات هيدروجيل على نطاق واسع (أي >1 مم) ، باستخدام الأغاروز كمادة نموذجية. تم اختيار الأغاروز بسبب قدرته العالية على امتصاص الماء ، وخصائص التبلور الذاتي الخاضعة للرقابة ، والخصائص الميكانيكية القابلة للضبط11،24،25،26. يدعم Agarose أيضا CFPS الوظيفي ، وهو أرخص من العديد من بدائل الهيدروجيل الأخرى ، وهو قابل للتحلل البيولوجي ، مما يجعله خيارا جذابا كنظام نموذجي تجريبي. ومع ذلك ، فقد تم إثبات هذه الطرق سابقا على أنها مناسبة لتضمين CFPS في مجموعة من الهلاميات المائيةالبديلة 11. بالنظر إلى المجموعة الواسعة من تطبيقات الهلاميات المائية ووظائف CFPS ، يمكن أن توفر الطرق الموضحة هنا أساسا يمكن للباحثين من خلاله تطوير مواد هيدروجيل محسنة بيولوجيا تناسب غاياتهم الخاصة.
في الدراسات السابقة ، تم استخدام أنظمة microgel ذات نطاق حجم من 1 ميكرومتر إلى 400 ميكرومتر لأداء CFPS في الهلاميات المائية المغمورة في مخزن التفاعل23،27،28،29،30،31. غير أن اشتراط غمر الهلاميات المائية داخل مخازن تفاعل CFPS يحد من فرص نشرها كمواد في حد ذاتها. تسمح البروتوكولات المقدمة هنا بحدوث تفاعلات CFPS داخل الهلاميات المائية دون الحاجة إلى غمر المواد الهلامية في مخازن التفاعل. ثانيا ، يسمح استخدام المواد الهلامية الكبيرة (بين 2 مم و 10 مم في الحجم) بدراسة التفاعل الفيزيائي بين الهلاميات المائية والتعبير الجيني الخالي من الخلايا. على سبيل المثال ، باستخدام هذه التقنية ، من الممكن دراسة كيفية تأثير مصفوفة الهيدروجيل على تفاعلات CFPS11 وكيف يمكن أن تؤثر تفاعلات CFPS على مصفوفة الهيدروجيل31. تسمح الأحجام الأكبر من الهلاميات المائية أيضا بتطوير مواد جديدة قابلة للبرمجة الحيوية32. أخيرا ، من خلال تضمين تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية ، هناك أيضا انخفاض محتمل في متطلبات أوعية التفاعل البلاستيكية. لنشر أجهزة الاستشعار الخالية من الخلايا ، فإن هذا له مزايا واضحة على الأجهزة التي تعتمد على الأدوات البلاستيكية. مجتمعة ، يوفر تضمين تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية العديد من المزايا لنشر الأجهزة الخالية من الخلايا خارج المختبر.
الهدف العام من الطرق المعروضة هنا هو السماح بتشغيل تفاعلات CFPS داخل مصفوفات الهيدروجيل. تم عرض طريقتين مختلفتين لتضمين تفاعلات إنتاج البروتين الخالية من الخلايا في مواد هيدروجيل واسعة النطاق (الشكل 1). في الطريقة أ ، يتم إدخال مكونات CFPS إلى الهلاميات المائية الأغاروز المجففة بالتجميد لتشكيل نظام نشط. في الطريقة ب ، يتم خلط الأغاروز المنصهر مع مكونات تفاعل CFPS لتشكيل نظام هيدروجيل CFPS كامل ، والذي يتم تجفيفه بالتجميد وتخزينه لحين الحاجة. يمكن إعادة إماهة هذه الأنظمة بحجم من الماء أو المخزن المؤقت وتحليلها لبدء التفاعل.
تستخدم هذه الدراسة الأنظمة القائمة على تحلل الخلايا الإشريكية القولونية. هذه بعض أنظمة CFPS التجريبية الأكثر شيوعا ، حيث أن تحضير محلول خلايا الإشريكية القولونية بسيط وغير مكلف ويحقق غلات عالية من البروتين. تستكمل محللة الخلية بالمكونات الجزيئية الكبيرة اللازمة لإجراء النسخ والترجمة ، بما في ذلك الريبوسومات ، والحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNAs) ، وتخليق أمينواسيل-الحمض النووي الريبي ، وعوامل البدء والاستطالة والإنهاء. على وجه التحديد ، توضح هذه الورقة إنتاج eGFP و mCherry في الهلاميات المائية للأغاروز باستخدام خلايا الإشريكية القولونية المحللة وتراقب ظهور التألق باستخدام قارئ الألواح والمجهر متحد البؤر. يمكن رؤية النتائج التمثيلية لقارئ لوحة المعايرة الدقيقة في Whitfield et al.31 ، والبيانات الأساسية متاحة للجمهور 33. علاوة على ذلك ، يتم تأكيد التعبير عن البروتينات الفلورية في جميع أنحاء المواد الهلامية باستخدام المجهر متحد البؤر. يسمح البروتوكولان الموضح في هذه الورقة بتجميع وتخزين الأجهزة الجينية القائمة على CFPS في المواد بهدف نهائي يتمثل في خلق بيئة مادية مناسبة لتوزيع دوائر الجينات الخالية من الخلايا بطريقة تدعم النشر الميداني.

<table><tbody><tr><td><قوي>المواد< / قوي>3-PGA</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية</td><td>sc-214793B</td><td></td></tr><tr><td>حمض الخليك</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>أجار</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>A10752.22</td><td></td></tr><tr><td>أغروز</td><td>سيفيرن بيوتك</td><td>30-15-50</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة عينات الأحماض الأمينية</td><td>VWR</td><td>BTRABR1401801</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A8937-1G</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>أنزيم أ (CoA)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>C4282-100MG</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>ألفا إيسار</td><td>J14121.MC</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>حمض الفولينيك</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Carbosynth</td><td>NG01208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H4034-25G</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamate</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G1149-100G</td><td></td></tr><tr><td>ليزوزيم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>ملغ غلوتامات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>49605-250 جرام</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>N6522-250MG</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>757551-5G</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة (K2HPO4)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>P3786-500G</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2PO4) كوكتيل</td> مثبط البروتياز <td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>طقم تركيز البروتين كيوبيت</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>A50668</td><td></td></tr><tr><td>روسيتا 2 DE 3 الإشريكية القولونية</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>71397-3</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>سبيرميدين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>85558-1G</td><td></td></tr><tr><td>تريبتون</td><td>ثيرمو فيشر 211705 العلمي</td><td></td><td></td></tr><tr><td>تريس</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>ألفا إيسار</td><td>J23160.MC مستخلص</td><td></td></tr><tr><td>الخميرة</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>Y1625-1KG</td><td></td></tr> <tr><td>< قوي > معدات < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1.5 مل أنابيب الطرد المركزي</td><td>الدقيقة سيجما ألدريتش</td><td>HS4323-500EA</td><td></td></tr><tr><td>10K MWCO أشرطة غسيل الكلى</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66381</td><td></td></tr><tr><td>15 مل أنبوب الطرد المركزي</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>50 مل زجاجات الطرد المركزي</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>500 مل زجاجات الطرد المركزي</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120-9500</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 1-2 LD Plus مجفف التجميد</td><td>المسيح</td><td>الجزء رقم 101521 ، 101522 101527</td><td></td></tr> جهاز <tr><td>طرد مركزي منضدة</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H-X3R</td><td></td></tr><tr><td>أسود 384 ألواح ميكروتيتر بئر</td><td>Fischer Scientific</td><td>66</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222S</td><td></td></tr><tr><td>Elga Purelab Chorus</td><td>Elga</td> <td>#####</td><td></td></tr> <tr><td>Eppendorf Microcentrifuge 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>EP00532</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي عالي السرعة</td><td>بيكمان كولتر</td><td>B34183</td><td></td></tr><tr><td>ترخيص JMP</td><td>معهد</td><td>SAS 15</td><td></td></tr><tr><td>نمام مغناطيسي</td><td>فيشر 15353518</td><td></td><td></td>علمي</tr><tr><td>بارافيلم</td><td>أمكور</td><td>PM-966</td><td></td></tr><tr><td>مقياس الطيف الضوئي (مقياس الضوء الحيوي)</td><td>Eppendorf</td><td>16713</td><td></td></tr><tr><td>الماصات ونصائح</td><td>جيلسون</td><td>#####</td><td></td></tr> ميزان <tr><td>الدقة</td><td>Sartorius</td><td>16384738</td><td></td></tr><tr><td>كيوبيت 2.0 مقياس الفلور</td><td>الحراري فيشر العلمي</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة اهتزاز</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>سونيك ديسممبراتور (سونيكاتور )</td> <td>حاضنة حراري فيشر العلمية</td><td>12893543</td><td></td></tr><tr><td>الثابتة</td><td>سانيو</td><td>MIR-162</td><td></td></tr><tr><td>حقنة وإبر</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66490</td><td></td></tr><tr><td>Thermo max Q8000 (حاضنة اهتزاز)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Lux Platereader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00GD1</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Cole-parmer</td><td>OU-04724-05</td><td></td></tr><tr><td>VWR PH 1100 L ، درجة الحموضة / mv/&deg ؛ ج متر</td><td>VWR</td><td>662-1657</td><td></td></tr></tbody></table>

طرق تضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية على نطاق واسع

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

توفر شبكات الجينات الاصطناعية منصة للعلماء والمهندسين لتصميم وبناء أنظمة جديدة ذات وظائف مشفرة على المستوى الجيني. في حين أن النموذج السائد لنشر شبكات الجينات هو داخل الهيكل الخلوي ، يمكن أيضا نشر شبكات الجينات الاصطناعية في بيئات خالية من الخلايا. تشمل التطبيقات الواعدة لشبكات الجينات الخالية من الخلايا أجهزة الاستشعار الحيوية ، حيث تم إثبات هذه الأجهزة ضد الأهداف الحيوية (فيروسات الإيبولا وزيكا و SARS-CoV-2) واللاأحيائية (المعادن الثقيلة والكبريتيدات والمبيدات الحشرية والملوثات العضوية الأخرى). عادة ما يتم نشر الأنظمة الخالية من الخلايا في شكل سائل داخل وعاء التفاعل. ومع ذلك ، فإن القدرة على تضمين مثل هذه التفاعلات في مصفوفة مادية قد تسهل تطبيقها على نطاق أوسع في مجموعة أوسع من البيئات. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير طرق لتضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) في مجموعة متنوعة من مصفوفات الهيدروجيل. واحدة من الخصائص الرئيسية للهلاميات المائية التي تفضي إلى هذا العمل هي قدرة إعادة تكوين المياه العالية لمواد الهيدروجيل. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك الهلاميات المائية خصائص فيزيائية وكيميائية مفيدة وظيفيا. يمكن تجفيف الهلاميات المائية بالتجميد للتخزين وإعادة ترطيبها لاستخدامها لاحقا. يتم تقديم بروتوكولين خطوة بخطوة لإدراج وفحص تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية. أولا ، يمكن دمج نظام CFPS في هيدروجيل عن طريق الإماهة باستخدام محلول الخلية. يمكن بعد ذلك تحفيز النظام داخل الهيدروجيل أو التعبير عنه بشكل أساسي للتعبير الكامل عن البروتين من خلال الهيدروجيل. ثانيا ، يمكن إدخال محللة الخلية إلى هيدروجيل عند نقطة البلمرة ، ويمكن تجفيف النظام بأكمله بالتجميد وإعادة ترطيبه في وقت لاحق باستخدام محلول مائي يحتوي على محفز لنظام التعبير المشفر داخل الهيدروجيل. هذه الطرق لديها القدرة على السماح بشبكات الجينات الخالية من الخلايا التي تمنح القدرات الحسية لمواد الهيدروجيل ، مع إمكانية نشرها خارج المختبر.

يفصل هذا البروتوكول طريقتين لتضمين تفاعلات CFPS في مصفوفات الهيدروجيل ، مع الشكل 1 يقدم نظرة عامة تخطيطية على النهجين. كلتا الطريقتين قابلة للتجفيف بالتجميد والتخزين طويل الأجل. الطريقة أ هي المنهجية الأكثر استخداما لسببين. أولا ، لقد ثبت أنها الطريقة الأكثر قابلية للتطبيق للعمل مع مجموعة من مواد الهيدروجيل11. ثانيا ، تسمح الطريقة أ بالاختبار المتوازي للتركيبات الجينية. الطريقة B هي أكثر ملاءمة لتصنيع نظام محسن ونشر ميداني. يسمح كلا البروتوكولين بإعداد العديد من العين...

هنا ، نقدم بروتوكولين لتضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في مصفوفات هيدروجيل على نطاق واسع دون الحاجة إلى مرحلة سائلة خارجية.

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...

نحن نعلم أن الأنظمة الحية تدمج باستمرار المعلومات من العديد من المصادر المختلفة وأن هذه الإشارات تؤدي إلى استجابات معقدة ودقيقة. يحدث الكثير من معالجة المعلومات هذه على المستوى الجزيئي. نحن مهتمون بتشغيل هذه العمليات داخل المواد، ولكن بدون خلايا.والغرض من ذلك هو إعطاء المواد وظائف جديدة. ترتبط التحديات في هذا العمل في المقام الأول بتفاعل تخليق البروتين الخالي من الخلايا ، بدلا من العمل مع هيدروجيل. يتطلب تفاعل الخلية محللة خلوية عالية الجودة بالإضافة إلى حمض نووي عالي الجودة ونقاء ليعمل بشكل جيد.يسمح هذا البروتوكول للباحثين بتضمين تفاعلات البيولوجيا الجزيئية في مادة فيزيائية قابلة للتحلل يمكن أخذها خارج المختبر. أيضا ، نظرا لأن ناتج التفاعل يتفاعل مباشرة مع هيكل المادة ، فهناك إمكانية لتطوير مواد ذات قدرات استشعار واستجابة جديدة. على المدى القصير ، نرى أن هذه الأساليب توفر طريقا جديدا لنشر أجهزة التشخيص الخالية من الخلايا.يسمح هذا البروتوكول بإنشاء عدد من الأجهزة وتنظيمها مكانيا بطريقة غير ممكنة للتفاعلات السائلة. إن مصالحنا المستقبلية ذات شقين. أولا ، نحن مهتمون بتوسيع طبيعة الهلاميات المائية التي نستخدمها لجلب المزيد من وظائف المواد إلى العمل.ثانيا ، نحن مهتمون بزيادة تعقيد وأداء شبكات الجينات التي نديرها في المواد الهلامية ، وتوسيع الوظائف البيولوجية لهذه الأنظمة.

methods-for-embedding-cell-free-protein-synthesis-reactions-macro

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نقدم بروتوكولات للتغليف (3D) 3 الأبعاد للخلايا داخل الهلاميات المائية الاصطناعية. ويرد الإجراء التغليف لمدة الأساليب المستخدمة عادة من يشابك (مايكل وبالإضافة إلى ذلك النوع الخفيف شرعت آليات الجذور الحرة) ، فضلا عن عدد من التقنيات لتقييم السلوك مغلفة الخلية.

تغليف الخلوية في الهلاميات المائية للهندسة الأنسجة 3D

في هذا البروتوكول ، ونحن إثبات تلفيق مجموعة من الوظائف microactuator عموديا على النازحين الذي يستند إليه التكنولوجيا ، وكيف يمكن تعديل هذه التكنولوجيا لإجراء قاعدة إنتاجية عالية خلية ثقافة ديناميكية ميكانيكيا في كل ثقافة ثنائي الابعاد وثلاثي الابعاد نماذج.

Microfabricated المنصات الحيوي للثقافة الخلية ميكانيكيا

وهذا الفيديو يوضح طريقة سريعة وفعالة لميتاكريليت بولي (جلايكول الإثيلين)، مما يتيح polymerizations سلسلة والتوليف هيدروجيل. فإنه سيتم شرح كيفية إدخال بالمثل ظائف methacrylamide في الببتيدات، بالتفصيل الأساليب التحليلية المشتركة لتقييم كفاءة functionalization، وتقديم الاقتراحات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها والتعديلات المتقدمة، وإظهار تقنيات توصيف هيدروجيل نموذجية.

Functionalization بمساعدة الميكروويف بولي (جلايكول الإثيلين) وعلى الراتنج الببتيدات للاستخدام في سلسلة Polymerizations وتشكيل هيدروجيل

نقدم توليف هيدروجيل تقسيم بوساطة intein البروتين. اللبنات الأساسية لهذا هيدروجيل نوعان من بوليمرات البروتين تحتوي كل منها على حدة فرعية من البروتين مثلوثي التي هي بمثابة crosslinker ونصف من intein الانقسام. خلط اثنين من بوليمرات بروتين يطلق رد فعل عبر الربط intein، مما أسفر عن وحدة ببتيد تتحول ذاتيا إلى هيدروجيل. هذا هو غاية هيدروجيل درجة الحموضة ودرجة الحرارة مستقرة، ومتوافقة مع المذيبات العضوية، ويشتمل على البروتينات الكروية بسهولة وظيفية.

التوليف من البروتين الاصطناعي Intein بوساطة هيدروجيل

نصف عملية متسلسلة للتكوين بوساطة الضوء والزخرفة الكيميائية الحيوية اللاحقة لمصفوفات الهيدروجيل الاصطناعية لتطبيقات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. يتم توضيح بناء وتعديل الهلاميات المائية مع كيمياء النقر الضوئي المتوافقة خليا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم تقنيات سهلة لتحديد الأنماط ومراقبتها وتحديد صلاحية الخلية داخل هذه الهلاميات المائية.

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

يتم تقييم أساليب مختلفة للتعامل مع بنية ثلاثية الأبعاد في الهلاميات المائية على أساس البروتين هنا فيما يتعلق بالخصائص المادية. شبكات ماكروبوروس هي فونكتيوناليزيد مع لاصقة الخلية ببتيد، وهو تقييم جدواها في خلية ثقافة استخدام اثنين من خطوط الخلية نموذجا مختلفاً.

سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية

في هذا الأسلوب، ونحن نستخدم فوتوبوليميريزيشن وتقنيات الكيمياء انقر لإنشاء أنماط البروتين أو الببتيد على السطح من البولي إيثيلين غليكول (شماعة) الهلاميات المائية، توفير معطلة إشارات النشطة بيولوجيا لدراسة الاستجابات الخلوية في المختبر .

الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

المؤتلف الهلاميات المائية هندسة البروتين مفيدة للثقافة خلية ثلاثية الأبعاد كما أنها تسمح لألواح كاملة للعمود الفقري البوليمر، ومن ثم المكروية الخلية. هنا، نحن تصف عملية تنقية المؤتلف الايلاستين مثل البروتين وتطبيقه في تغليف خلية 3D المائية.

إنتاج بروتين الايلاستين مثل الهلاميات المائية للتغليف وإيمونوستينينج من الخلايا في 3D

ويرد هنا، بروتوكولا لتغليف واستزراع الخلايا في الهلاميات المائية poly(ethylene glycol) (شماعة) فونكتيوناليزيد مع أية مصفوفة فلوروجينيك (MMP)-الببتيد القابلة للتحلل. يتم قياس MMP الخلوية والنشاط الأيضي مباشرة من الثقافات المائية باستخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية.

قياس أية مصفوفة الخلوية العالمية والنشاط الأيضي في الهلاميات المائية 3D

توضح هذه المقالة بروتوكولات تصنيع هلام الجيلاتين ميثاكريلويل عالي الإنتاجية باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة ، وتحويل الهلاميات الدقيقة إلى مسحوق قابل للإنعاش (الهلاميات الهوائية الدقيقة) ، والتجميع الكيميائي للهلام الدقيق لتشكيل سقالات هيدروجيل حبيبية ، وتطوير أحبار هيدروجيل حيوية حبيبية مع مسامية دقيقة محفوظة للطباعة الحيوية 3D.

سقالات هيدروجيل الحبيبية الجيلاتين ميثاكريلويل: تصنيع ميكروجيل عالي الإنتاجية ، التجفيد ، التجميع الكيميائي ، والطباعة الحيوية 3D

اكتشف بروتوكولات تضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية باستخدام مستخلصات E. coli. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من تطوير أجهزة تشخيصية جديدة تعمل خارج المختبر.

طرق تضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية على نطاق واسع

استكشف المزيد من الفيديوهات