Name: ضربة قاضية مستهدفة للجينات في الضفيرة المشيمية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: اكتشف تقنيات استهداف الجينات في الضفيرة المشيمية باستخدام حقن ICV ونواقل AAV2/5 في نماذج الفئران. تُمكّن هذه الطرق الباحثين من دراسة وظائف الدماغ وتطوير علاجات جديدة لأمراض مثل التصلب المتعدد.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونعرب عن امتناننا للدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31800903، الممنوحة ل W. Zheng) ومشروع ونتشو للعلوم والتكنولوجيا (رقم Y2020426، الذي منح إلى Y. Y. Weng) لهذا العمل.

تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الموضحة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة ونتشو الطبية.
1. الحيوانات
<ol><li>شراء ذكور C57BL / 6 فئران تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا ويزن 20-22 جم.</li>
	<li>احصل على خط الفأر Rosa-LSL المعدل وراثيا (Lox-StoP-Lox) -tdTomato (Ai9) ، وذكور الفئرانA 2AR flox/ flox .</li>
	<li>قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعتين والمنزل في أقفاص ، بحد أقصى خمسة فئران لكل قفص ، تحت دورة مظلمة قياسية مدتها 12 ساعة / 12 ساعة لمدة أسبوع واحد.</li>
	<li>تزويد الفئران بما يكفي من الطعام والماء والحفاظ عليها عند درجة حرارة ثابتة عند 25 درجة مئوية.</li>
</ol>2. ضربة قاضية خاصة ب ChP ل A2ARs مع AAV2 / 5-shRNA
<ol><li>وزن كل ماوس وكتابة القيم.</li>
	<li>تخدير الفئران داخل الصفاق ب 1٪ من صوديوم بنتوباربيتال بجرعة 6-8 مل / كجم تعادل 60-80 مجم / كجم بنتوباربيتال ، وضع الماوس على وسادة تدفئة لإبقائه دافئا. ملاحظة: من الضروري إعطاء الجرعة الصحيحة من صوديوم بنتوباربيتال وفقا لوزن الفأر لضمان نجاح الجراحة. يجب ألا يكون التخدير عميقا جدا ، لأنه قد يؤدي إلى الوفاة ، ولكن لا ينبغي أن يكون ضحلا جدا ، حيث قد يستيقظ الفأر أثناء العملية ، مما قد يؤثر على فعالية حقن الفيروس. تحقق من جرعة التخدير المناسبة عن طريق قرصة إصبع القدم وتأكد من أن الفئران لا تستجيب.</li>
	<li>استخدم ماكينة حلاقة فأر متخصصة لقص الشعر العلوي للفئران المخدرة.</li>
	<li>ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف ، وقم بتثبيت الفئران على جهاز تجسيمي لشل حركة الدماغ. تغطية الحيوان مع ثنى معقمة.</li>
	<li>تعقيم جلد الرأس والرقبة من الفئران تماما مع ثلاث جولات من مطهر اليودوفور والكحول 75 ٪ للحد من العدوى بعد العملية الجراحية. ثم ضع 1٪ يدوكائين موضعيا على فروة رأس الفئران وقم بعمل شق صغير لفضح الجمجمة بالكامل تحت المجهر. ملاحظة: استخدم أدوات معقمة طوال العملية.</li>
	<li>قم بإعداد حقنتين سعة 10 ميكرولتر: واحدة مع AAV2 / 5-A 2A R-shRNA المشتراة (عيار: 6.27 × 10 9 vg / μL) والأخرى مع AAV2 / 5-Scramble المشتراة (عيار:6.21× 109 vg / μL). ملاحظة: عند استخدام المحقنة ، يجب توصيل الواجهة الأمامية بشعيرات زجاجية ، ويمكن الحصول على نطاق 10 ميكرولتر عن طريق التحكم في طول الشعيرات الدموية الزجاجية.</li>
	<li>استخدم المجهر لتحديد موقع bregma و lambda وتعيين نقطة الإحداثيات (AP: -0.58; ML: ±1.10; DL: -2.20) على حقنة 10 ميكرولتر (الشكل 1). تعتمد نقطة الإحداثيات على الأطلس التجسيمي لدماغ الفأر15.</li>
	<li>حفر ثقب صغير في الجمجمة عند نقطة الإحداثيات المعدلة. ملاحظة: تحت المجهر ، يتم إجراء الحفر باستخدام مثقاب دقيق معقم على سطح الجمجمة. بعد الحفر ، عن طريق إزالة السحايا التي تغطي الدماغ وكشف حمة الدماغ الكامنة ، يتم منع إصابة الأوعية الدموية. تمنع هذه الخطوة طرف الشعيرات الدموية الزجاجية من الكسر بواسطة السحايا. يجب أن يكون قطر الثقب المحفور كافيا للسماح لطرف الإبرة بدخول أنسجة المخ.</li>
	<li>تطبيق 2 ميكرولتر من فيروس AAV2 / 5-A2AR-shRNA في بطين الدماغ عن طريق الحقن الجانبي بمعدل ثابت 100 nL / دقيقة. احتفظ بالإبرة في مكانها لمدة 10 دقائق قبل الانسحاب. لاحظ أن الفيروس كان يدار عن طريق الحقن من جانب واحد.</li>
	<li>أغلق الجلد المصاب باستخدام غراء البيوفيبرين الطبي على الفور لمنع فقدان الفيروس ، والذي يمكن شطفه باستخدام السائل الدماغي الشوكي بعد إزالة الإبرة إذا لم يتم تطبيق الغراء بسرعة. أيضا ، لا تستخدم أعواد القطن لمسح السائل الدماغي النخاعي ، لأنها قد تسبب أيضا فقدان الفيروس.</li>
	<li>لتسهيل الشفاء ، ضع الماوس على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37.0 ± 0.5 درجة مئوية ، وقم بتطبيق 1٪ ليدوكائين موضعيا على فروة رأس الفأر. اسمح للفئران بالتعافي لمدة أسبوعين قبل تحفيز نموذج EAE ، لأن هذه الفترة ضرورية لتعبير فيروس AAV2 / 5-A 2A R-shRNA وضربة قاضية A2AR اللاحقة.</li>
</ol>3. ضربة قاضية خاصة ب ChP ل A2AR مع Cre / locus لنظام X-overP1 (Cre / LoxP)
ملاحظة: يمكن تحقيق الإجراءات التالية باستخدام الطريقة الموضحة سابقا. راجع الخطوات 2.1-2.11 للحصول على طرق الحقن التفصيلية.
<ol><li>حقن 2 ميكرولتر من CRE-TAT recombinase في كل بطين جانبي لفأر Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato كمجموعة تجريبية و 2 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) كمجموعة ضابطة. باستخدام نفس البروتوكول المذكور أعلاه (القسم 2) ، قم بحقن 2 ميكرولتر من CRE-TAT recombinase في كل من البطينين الجانبيين للفئرانA 2AR flox/ flox جنبا إلى جنب مع 2 ميكرولتر من PBS المعقمة كمجموعة تحكم.</li>
	<li>تحضير أقسام الأنسجة المجمدة وإجراء تلطيخ نووي بعد 2 أسابيع من حقن CRE-TAT recombinase. راجع الخطوات 4.1-4.3 للحصول على مزيد من المعلومات.</li>
</ol>4. التروية عبر القلب في الفئران
<ol><li>تطبيق 60-80 ملغ/ كغ من صوديوم بنتوباربيتال لتخدير الفئران بعمق. قم بتأكيد مستوى التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم وقم بإجراء التروية عبر القلب باستخدام 40 مل من محلول PBS المعقم متبوعا ب 20 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). ملاحظة: يشار إلى التروية الناجحة باللون الأبيض في الكبد ، في حين أن وجود رئتين متضخمتين أو تدفق PBS من الفم أثناء التروية يشير إلى فشل الإجراء.</li>
	<li>استخراج دماغ الفأر بسرعة ، وضمان الحد الأدنى من تدهور البروتين.</li>
	<li>اغمر دماغ الفأر في 4٪ PFA / PBS طوال الليل لما بعد التثبيت ، متبوعا بالاستبدال بمحلول 30٪ سكروز PB لمدة 72 ساعة. ملاحظة: من الأهمية بمكان تجنب الجفاف المفرط لأنسجة المخ ، لذلك لا ينبغي ترك الدماغ في محلول السكروز PB لفترة طويلة.</li>
</ol>5. تقسيم الأنسجة المجمدة وتلطيخها
<ol><li>قم بتضمين دماغ الفأر المجفف سابقا في غراء درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، وقم بتجميد الدماغ المضمن ، واستخدم ميكروتوم منزلق لقطع المقاطع الإكليلية بسمك 20 ميكرومتر.</li>
	<li>ضع أقسام الدماغ على الشريحة الزجاجية. بمجرد أن تجف أقسام الدماغ ، قم بتخزينها في ثلاجة -20 درجة مئوية لإجراء تجارب لاحقة.</li>
	<li>ضع كل شريحة زجاجية في علبة إطار واغمر الإطار في وعاء مملوء ب PBS لشطف الشريحة جيدا. شطف بلطف شرائح الدماغ مع حل PBS ثلاث مرات ، لمدة 10 دقائق في كل مرة. ملاحظة: يجب توخي الحذر لمنع أقسام الدماغ من السقوط من الشريحة الزجاجية.</li>
	<li>قم بتلطيخ شرائح الدماغ بمحلول 4 ′،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>شطف شرائح الدماغ بمحلول PBS لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>ضع قطرة واحدة من وسيط تركيب مضاد التلاشي على أقسام الدماغ.</li>
	<li>ضع غطاء على أقسام الدماغ ، وأغلق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر ، وحلل الأقسام باستخدام مجهر مضان تقليدي.</li>
</ol>6. تحريض EAE
ملاحظة: إجراء تحريض EAE بعد أسبوعين من حقن shRNA أو CRE-TATrecombinase 11.
<ol><li>قم بإنشاء محلول مائي عن طريق خلط 2.5 ملغ من البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG35-55) مع 2 مل من PBS. قم بإعداد محلول زيت فرويندز المساعد (CFA) الكامل عن طريق خلط المتفطرة السلية (H37Ra) مع مساعد فرويندز غير المكتمل (IFA).</li>
	<li>امزج المحاليل المائية والزيتية بنسبة 1: 1. استخدم أنبوب الإنطلاق لخفق الخليط في حالة الزيت في الماء. ملاحظة: يسمى أنبوب نقطة الإنطلاق أيضا أنبوبا ثلاثي الاتجاهات. إنه أنبوب بلاستيكي يمكنه التحكم في اتجاه المحلول المتدفق لخلط MOG35-55 و CFA بالكامل.</li>
	<li>استخدم خالط عالي السرعة لصنع مستحلب مستضد MOG لنموذج EAE في ظل ظروف حمام الجليد.</li>
	<li>تخدير الفئران داخل الصفاق ب 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم بجرعة 6-8 مل / كجم تعادل 60-80 مجم / كجم بنتوباربيتال.</li>
	<li>حقن مستحلب مستضد MOG تحت الجلد في أربع نقاط مختلفة (الرقبة والظهر والوركين الأيسر والأيمن) بحجم 10 مل / كجم لما مجموعه أربع حقن لكل منهما. ملاحظة: من المهم اختيار موقع الحقن بعناية ، حيث قد يكون للمواقع المختلفة تأثيرات متفاوتة على مراضة الفئران ووفياتها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي حقن MOG المتكررة إلى تحمل المناعة ، لذلك اختار فريق البحث طريقة حقن واحدة لمنع هذه المشكلة المحتملة.</li>
	<li>يحقن فورا 500 نانوغرام/مل من سم السعال الديكي (PT) داخل الصفاق بجرعة 5 ملغ/كغ بعد حقن MOG. ملاحظة: يزيد PT من نفاذية الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ويسهل تسلل الخلايا التائية إلى الدماغ.</li>
	<li>بعد 48 ساعة ، قم بحقن محلول PT داخل الصفاق بنفس الحجم.</li>
</ol>7. درجة العجز العصبي
<ol><li>تقييم وتصنيف الفئران يوميا باستخدام مقياس تصنيف 16 يتراوح من 0 إلى15 لتقييم حدوث وشدة EAE وفقا للعجز العصبي التالي: الذيل: 0 يشير إلى عدم وجود علامات ، 1 يمثل ذيلا نصف مشلول ، و 2 يشير إلى ذيل مشلول تماما. الأطراف: 0 تشير إلى عدم وجود علامات ، 1 تمثل مشية ضعيفة أو متغيرة ، 2 تشير إلى شلل جزئي ، و 3 تمثل طرفا مشلولا تماما.</li>
	<li>تعيين مصاب بالشلل الرباعي المصاب بالشلل التام بدرجة 12 ، وتعيين معدل وفيات بدرجة 15.</li>
</ol>8. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H&E)
<ol><li>خذ دماغ الفأر المجفف وقم بتضمينه في البارافين المنصهر. اترك كتلة البارافين لتبرد وتتصلب لاستخدامها لاحقا. ملاحظة: يجب أن تكون كتلة البارافين جافة تماما وباردة لتجنب تلف الأنسجة.</li>
	<li>قطع كتلة البارافين الدماغ الفأر إلى شرائح 5 ميكرومتر. ضع قسم دماغ فأر البارافين على شريحة زجاجية وجففه في فرن 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.</li>
	<li>اغمر الشرائح بالتتابع في محلول الزيلين I لمدة 10 دقائق ، ومحلول الزيلين II لمدة 10 دقائق ، والكحول 100٪ I لمدة 3 دقائق ، والكحول 100٪ II لمدة 3 دقائق ، والكحول 95٪ لمدة 3 دقائق ، والكحول 90٪ لمدة 3 دقائق ، والكحول بنسبة 80٪ لمدة 3 دقائق ، والكحول بنسبة 70٪ لمدة 3 دقائق ، والماء المقطر لمدة 1 دقيقة.</li>
</ol>9. تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR)
<ol><li>بعد تعطير الفئران مع PBS ، قم بإزالة ChP من البطينين واستخراج الحمض النووي الريبي مع Trizol. توليف cDNA باستخدام أول مجموعة توليف cDNA ستراند.</li>
	<li>قم بإجراء تحليل qPCR باستخدام بريمكس Ex Taq SYBR-green ونظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. استخدم البادئاتA 2AR التالية: إلى الأمام - GCCATCCCATTCGCCATCA ؛ عكس - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

إسكات الجينات الانتقائي في الضفيرة المشيمية

<ol><li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li>
<li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li>
<li>Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease.</a> Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35(2020).</li>
<li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease%3A+dialogues+into+and+out+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li>
<li>Myung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+is+an+important+circadian+clock+component%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus is an important circadian clock component.</a> Nature Communications. 9 (1), 1062(2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+FOXJ1-Cre+system+for+gene+inactivation+in+ciliated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).</li>
<li>Johansson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Otx2+regulates+choroid+plexus+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function.</a> Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+NKCC1+mediates+cerebrospinal+fluid+clearance+during+mouse+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development.</a> Nature Communications. 12 (1), 447(2021).</li>
<li>Spatazza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid-plexus-derived+Otx2+homeoprotein+constrains+adult+cortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity.</a> Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).</li>
<li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus-selective+inactivation+of+adenosine+A2A+receptors+protects+against+T+cell+infiltration+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52(2022).</li>
<li>Steffensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotransporter-mediated+water+transport+underlying+cerebrospinal+fluid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation.</a> Nature Communications. 9 (1), 2167(2018).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+controls+the+brain-immune+system+interface+in+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+serotypes+of+adeno-associated+virus+vector-+and+lentivirus-mediated+tropism+in+choroid+plexus+by+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery.</a> Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).</li>
<li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).</li>
<li>Weaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elevated+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+is+protective+by+affecting+Th1%2FTh2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization.</a> FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).</li>
<li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5 (5), 4111(2019).</li>
<li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Reboldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-C+chemokine+receptor+6-regulated+entry+of+TH-17+cells+into+the+CNS+through+the+choroid+plexus+is+required+for+the+initiation+of+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE.</a> Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+connexin+43+expression+and+gap+junction+flexibility+are+associated+with+clinical+features+of+acute+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+brain+stimulation+upregulates+adhesion+and+prevents+Eae%3A+MMP-2%2C+ICAM-1%2C+and+VCAM-1+in+the+choroid+plexus+as+a+target%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target.</a> International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).</li>
<li>Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+adenosine+signaling+induces+CX3CL1+expression+in+the+brain+to+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 193(2012).</li>
</ol>

ويذكر صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة أو إفصاحات أخرى يعلنان عنها.

قدم البحث نهجين متميزين للضربة القاضية المستهدفة لجينات ChP. تضمن النهج الأول حقن ICV ل CRE-TAT ، الذي يحتوي على Cre recombinase ، في الفئرانA 2AR flox/ flox. أما النهج الثاني فينطوي على حقن القيمة المحلية ل AAV2/5 الذي يحمل الحمض النووي الريبوزي الريبي منA 2AR. من خلال استخدام هاتين الاستراتيجيتين ، حقق العمل ضربة قاضية انتقائية ل A 2A R داخل ChP وكان قادرا على إظهار الآثار الوقائية لتثبيط إشاراتA 2AR في ChP على أمراض EAE. وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يتضمن خ...

غالبا ما كان يعتقد أن الضفيرة المشيمية (ChP) تساعد في الحفاظ على التوازن الوظيفي للدماغ عن طريق إفراز السائل النخاعي (CSF) وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) 1,2. كشفت الأبحاث المتزايدة على مدى العقود الثلاثة الماضية أن ChP يمثل مسارا متميزا لتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS).
تحافظ الوصلات الضيقة (TJs) ل ChP ، المكونة من ظهارة ChP أحادية الطبقة ، على التوازن المناعي عن طريق منع الجزيئات الكبيرة والخلايا المناعية من دخول الدماغ3. ومع ذلك ، في ظل ظروف مرضية معينة ، يكتشف نسيج ChP ويستجيب للأنماط الجزيئية المرتبطة بالخطر (DAMPs) في السائل الدماغي النخاعي والدم ، مما يؤدي إلى تسلل مناعي غير طبيعي وخلل وظيفي في الدماغ 4,5. على الرغم من دوره الحاسم ، فإن صغر حجم ChP وموقعه الفريد في الدماغ يجعل من الصعب دراسة وظيفته دون التأثير على مناطق الدماغ الأخرى. لذلك ، فإن معالجة التعبير الجيني على وجه التحديد في ChP هو نهج مثالي لفهم وظيفته.
في البداية ، كانت الخطوط المعدلة وراثيا لإنزيم إعادة التركيب الدائري (Cre) ، والتي تعبر عن Cre تحت سيطرة المروجين الخاصين بالجينات المعبر عنها في ChP ، تستخدم بشكل شائع لحذف الجينات المستهدفة عن طريق التكاثر بجينات مرشحة متخبطة6،7،8. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن عامل النسخ Forkhead box J1 (FoxJ1) حصريا في ظهارة ChP لدماغ الفأرقبل الولادة 7. وهكذا ، غالبا ما تم استخدام خط FoxJ1-Cre لحذف الجينات الموجودة في ChP 6,9. ومع ذلك ، فإن نجاح هذه الاستراتيجية يعتمد بشكل كبير على خصوصية المروج. تم اكتشاف تدريجيا أن نمط تعبير FoxJ1 لم يكن مميزا بما فيه الكفاية ، حيث كان FoxJ1 موجودا أيضا في الخلايا الظهارية الهدبية في أجزاء أخرى من الدماغ والجهاز المحيطي7. للتغلب على هذا القيد ، تم إجراء حقن داخل الدماغ البطيني (ICV) من Cre recombinase لتوصيل recombinase إلى البطينين من الخطوط المعدلة وراثيا floxed. أظهرت هذه الاستراتيجية خصوصية عالية ، كما يتضح من وجود مضان tdTomato فقط في أنسجة ChP10,11. ومع ذلك ، لا تزال هذه الطريقة محدودة بسبب توفر خطوط الماوس المعدلة وراثيا. لمعالجة هذه المشكلة ، استخدم الباحثون حقن ICV للفيروس المرتبط بالغدي (AAV) لتحقيق ضربة قاضية خاصة ب ChP أو الإفراط في التعبير عن الجينات المستهدفة12,13. كشف تقييم شامل للأنماط المصلية المختلفة لعدوى AAV لعدوى ChP أن AAV2 / 5 و AAV2 / 8 يظهران قدرات عدوى قوية في ChP ، بينما لا يصيبان مناطق الدماغ الأخرى. ومع ذلك ، وجد أن AAV2 / 8 يصيب البطانة العصبية المحيطة بالبطينين ، في حين أن مجموعة AAV2 / 5 لم تظهر أي عدوى14. هذه الطريقة لها ميزة التغلب على قيود الحصول على الحيوانات المعدلة وراثيا.
توضح هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة لضربة قاضية للجين في ChP باستخدام طريقتين: ICV ل AAV2 / 5 الذي يحمل shRNA لمستقبل الأدينوزين A 2A (A 2A R) وبروتين Cre recombinase الذي يتكون من تسلسل TAT (CRE-TAT) RECOMBINASE لتحقيق ضربة قاضية خاصة ب ChP لA 2A R. تشير نتائج الدراسة إلى أن هدمA 2AR في ChP يمكن أن يخفف من التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). يوفر هذا البروتوكول التفصيلي إرشادات مفيدة لدراسات وظائف ChP والضربة القاضية المحددة للجينات في ChP.

<table><tbody><tr><td>A2ARflox / flox</td><td>مختبر الدولة الرئيسي للفئران لطب العيون والبصريات والعلوم البصرية ، جامعة</td><td></td><td></td>ونتشو الطبية</tr><tr><td>AAV2 / 5-A2AR-ShRNA</td><td>virus Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td><td>pt-4828</td><td></td></tr><tr><td>مضاد للتلاشي تصاعد متوسط</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>زجاج البورسليكات الشعري</td><td>بكين Meiyaxian التكنولوجيا المحدودة</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>جهاز الدماغ التجسيمي</td><td>RWD ، شنتشن</td><td>69100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6 الفئران</td><td>بكين فيتال تشارلز ريفر مختبر شركة</td><td></td><td></td>تكنولوجيا</tr><tr><td>CRE-TAT إعادة التركيب</td><td>ميليبور</td><td>SCR508</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Absin</td><td>B25A031</td><td></td></tr><tr><td>آلة التقطيع المجمدة</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>H37Ra</td><td>Becton Dickinson وشركاه</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>حقنة هاميلتون</td><td>هاميلتون ، الأمريكية</td><td>P / N: &nbsp ؛ 86259</td><td></td></tr><tr><td>غير مكتمل Freunds مساعد</td><td>Sigma</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>مجهر ليزر متحد البؤر</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td></td></tr><tr><td>MOG 35-55</td> <td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co.، LTD</td><td>4010006243</td><td></td></tr><tr><td>OCT الغراء</td><td>Epredia</td><td>6502p</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>بندقية بنتوباربيتال الصوديوم</td><td>Boyun Biotech</td><td>PC13003</td><td></td></tr><tr><td>ماصة</td><td>Eppendorf</td><td>N45014F</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis</td><td>Kit Takara</td> <td>&nbsp; 6110A</td><td></td></tr><tr><td>نظام PCR في الوقت الحقيقي</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox) -tdفئران الطماطم</td><td>مختبر</td><td></td><td></td>جاكسون</tr><tr><td>السكروز</td><td>سانجون Biotech</td><td>A502792-0500</td><td></td></tr><tr><td>الخالط فائق السرعة</td><td>IKA</td><td>3737025</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>محلول</td> <td>الزيلينشركة الكاشف الكيميائي تشنغدو كيلونج</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

ضربة قاضية مستهدفة للجينات في الضفيرة المشيمية

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

تعمل الضفيرة المشيمية (ChP) كبوابة حرجة لتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. أظهرت الأبحاث الحديثة أن تنظيم نشاط ChP قد يوفر الحماية ضد اضطرابات الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن دراسة الوظيفة البيولوجية ل ChP دون التأثير على مناطق الدماغ الأخرى أمر صعب بسبب هيكله الدقيق. تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لضربة قاضية للجينات في أنسجة ChP باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAVs) أو بروتين إعادة التركيب الدائري (Cre) الذي يتكون من تسلسل TAT (CRE-TAT). تظهر النتائج أنه بعد حقن AAV أو CRE-TAT في البطين الجانبي ، كان التألق يتركز حصريا في ChP. باستخدام هذا النهج ، نجحت الدراسة في إسقاط مستقبل الأدينوزين A 2A (A2A R) في ChP باستخدام تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) أو Cre / locus لأنظمة X-overP1 (Cre / LoxP) ، وأظهرت أن هذه الضربة القاضية يمكن أن تخفف من أمراض التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). قد يكون لهذه التقنية آثار مهمة على الأبحاث المستقبلية حول دور ChP في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي.

ضربة قاضية A2AR خاصة ب ChP عن طريق حقن ICV ل AAV2 / 5-shRNA أو CRE-TAT لا يزال دور A2AR في ChP كمنظم قوي للمعلومات العصبية في التسبب في EAE غير واضح. يمكن أن يؤدي هدم تعبير A 2A R الخاص ب ChP إلى إلقاء الضوء على التأثيرات التنظيمية A2AR على الجهاز المناعي المركزي في EAE والتهابات الجهاز العصبي الأخرى. استخدمت هذه الدراسة حقن ICV من CRE-TAT لتقليل تعبيرA2A R في ChP للفئرانA 2AR flox/ flox. لضمان خصوصية ChP ، قمنا أولا بحقن CRE...

هنا ، نصف طريقة لتغيير التعبيرات الجينية بشكل انتقائي في الضفيرة المشيمية مع تجنب أي تأثير في مناطق الدماغ الأخرى.

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

الهدف من هذا البحث هو التحقيق في تقنيات التلاعب بالتعبير الجيني في الضفيرة المشيمية. قدمت دراستنا الطريقتين اللتين تسمحان بالتقنية حصريا في الضفيرة المشيمية دون أي تأثير ملحوظ على المناطق الأخرى. يمكن أن تعزز النتائج التي توصلنا إليها الدراسات الوظيفية المستقبلية للضفيرة المشيمية في علم الأعصاب.استعرض بحثنا أن تثبيط تسلل الخلايا التائية عبر الضفيرة المشيمية من خلال الإغلاق الانتقائي للأدينوزين إلى مستقبل كاف لحماية الفئران من أمراض EAE. تدعم هذه النتيجة فكرة أن اكتشاف نشاط البوابة في الضفيرة المشيمية يمكن أن يقدم استراتيجية جديدة واعدة لعلاج التصلب المتعدد. تقدم هذه الدراسة طريقتين بديلتين لمعالجة التعبير الجيني في الضفيرة المشيمية.حقن ICV من Cre recombinase في تلك الفئران المعدلة وراثيا أو حقن ICV من AAV2 / 5 ، أو أنه يستهدف SHI في الفئران WT. تتغلب هذه الطرق على المشكلات المتعلقة بتعزيز الخصوصية وتربية الفئران عبر الجينات.

targeted-knockdown-of-genes-in-the-choroid-plexus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

تم وصف طريقة لضربة قاضية مشروط التعبير بروتين هدف في شبكية العين الزرد الكبار ، والذي ينطوي على حقن العقاقير وintravitreally morpholinos electroporating لهم في شبكية العين. طرقت هو البروتين الناتج باستمرار لعدة أيام ، والذي يسمح اختبار دور البروتين في تجديد أو شبكية العين سليمة.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

في هذا الفيديو ، نوضح طريقة لإجراء نقل نواقل shRNA الفيروسية للحصول على خطوط خلية قاضية مستقرة في الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (iHSPCs).

ضربة قاضية جينية بوساطة الحمض النووي الريبي القصيرة في iHSPCs في المختبر: يتم تسليم نظام تعبير الحمض النووي الريبي shRNA القائم على فيروس الونس إلى iHSPCs للتخلص من التعبير الجيني المحدد

ونحن يبرهن على وجود تقنية مينيملي ويشار إلى الولدان الصعق الكهربائي منطقة subventricular. تقنية حقن الحمض النووي يتكون من البلازميد إلى البطينين الوحشي للالجراء حديثي الولادة وتطبيق التيار الكهربائي لتقديم والتلاعب وراثيا الخلايا الجذعية...

الوليد الصعق الكهربائي المنطقة Subventricular

في هذه المقالة، ونحن يبرهن على وجود طريقة للتلاعب في التعبير الجيني في الخلايا البطين من الدماغ الانتهائي الزرد الكبار باستخدام العقاقير أليغنوكليوتيد] morpholino. نقدم هذه الطريقة كبروتوكول فعالة وسريعة والتي يمكن استخدامها للدراسات وظيفية في الفقاريات الدماغ الكبار.

المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

خطوط الخلايا مراسل توفر وسيلة لتصور، وتتبع وعزل الخلايا من الاهتمام من السكان غير متجانسة. ومع ذلك، باستخدام إعادة التركيب مثلي التقليدية في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية استهداف الجين غير فعال للغاية. هنا، نحن تصف استهداف CNS محدد المخ الأوسط عامل النسخ PITX3 موضع مع EGFP باستخدام إصبع الزنك نوكلياز تعزيز إعادة التركيب مثلي.

الزنك الاصبع نوكلياز المحسن استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

تلين عقيدية هيتيروتوبيا (هايتي) هو الشكل الأكثر شيوعاً لتشوه التنمية القشرية (MCD) في مرحلة البلوغ ولكن الأساس الجيني لا يزال غير معروف في بعض الحالات المتفرقة أكثر. مؤخرا قمنا بتطوير استراتيجية لتحديد الجينات المرشحة رواية ل MCDs وتؤكد على دور العامل المسبّب في فيفومباشرة.

رواية استراتيجية الجمع بين CGH الصفيف وتعاقب كل اكسومي وانهانسر في الرحم في القوارض لتحديد الجينات المسببة لتشوهات الدماغ

يوفر هذا البروتوكول سير عمل في كيفية الجمع بين تدخل الجيش الملكي النيبالي microRNA بوساطة الاصطناعية مع أوبتوجينيتيكس لحفز على وجه التحديد presynaptic boutons مع انخفاض التعبير عن gene(s) انتقائية داخل الدوائر العصبية سليمة.

الجمع بين أوبتوجينيتيكس ميكرورناس الاصطناعية لتوصيف "تأثيرات الجينات ضربة قاضية" في وظيفة Presynaptic داخل "الدوائر العصبية سليمة"

في هذه الدراسة ، تم هدم التعبير لاثنين من مكونات الإشارات النهائية لمسار PERK ، الكالسينورين الواقي للخلايا و CHOP المؤيد لموت الخلايا المبرمج ، باستخدام shRNAs محددة. بطرق معاكسة ، تعدل هذه قابلية الخلايا العصبية القشرية الأولية لضمور الخلايا العصبية بعد تحريض إجهاد الشبكة الإندوبلازمية.

التعديل الجزيئي بواسطة shRNAs المحددة التي يتم توصيلها بواسطة فيروس Lentivirus في الخلايا العصبية المجهدة للشبكة الإندوبلازمية

لقد طورنا نهجا جديدا لفقدان الوظيفة يتضمن إدخال تسلسل الحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي ودمجه الجينومي في أجنة الفرخ باستخدام التثقيب الكهربائي في البويضات ونظام ترانسبوزون Tol2. توفر هذه التقنية منهجية قوية ومستقرة لضربة قاضية للجينات لدراسات وظيفة الجينات أثناء التطوير.

نهج فقدان الوظيفة في شبكية العين الجنينية باستخدام التعبير الوراثي بوساطة Tol2 transposon للحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي

يوفر التثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية للرئيسيات نهجا دقيقا وفعالا لإدخال تعديل (تعديلات) وراثية عابرة في أنواع مختلفة من السلف والخلايا العصبية في نظام نموذجي قريب من تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية للرئيسيات (المرضية). هذا يسمح بدراسة العمليات العصبية النمائية والتطورية ويمكن أيضا تطبيقه على نمذجة المرض.

الحقن المجهري المستهدف والتثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية الرئيسية للتعديل الوراثي

هنا ، نقدم التلاعب الجيني الحاد للعضيات القشرية البشرية المقطعة عن طريق التثقيب الكهربائي. هذه النماذج العضوية القشرية قابلة بشكل خاص للحقن حيث يمكن التعرف بسهولة على الهياكل الشبيهة بالبطين بعد التقطيع ، مما يتيح التحقيق الوظيفي للتطور القشري البشري ، واضطرابات النمو العصبي ، والتطور القشري.

التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية المقطعة لدراسات وظيفة الجينات

اكتشف تقنيات استهداف الجينات في الضفيرة المشيمية باستخدام حقن ICV ونواقل AAV2/5 في نماذج الفئران. تُمكّن هذه الطرق الباحثين من دراسة وظائف الدماغ وتطوير علاجات جديدة لأمراض مثل التصلب المتعدد.

ضربة قاضية مستهدفة للجينات في الضفيرة المشيمية

استكشف المزيد من الفيديوهات