استخدام تصوير الخلايا الحية المنقولة جنسيا لتصور البنية التحتية للغشاء الداخلي للميتوكوندريا في نماذج الخلايا العصبية
June 30th, 2023
يقدم هذا البروتوكول سير عمل لنشر وتمايز وتلطيخ خلايا SH-SY5Y المستزرعة والخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران لتصور وتحليل البنية الفوقية للميتوكوندريا باستخدام الفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED).
يركز برنامجنا البحثي على الجوانب الهيكلية والوظيفية للميتوكوندريا ، لا سيما فيما يتعلق بالخلل الوظيفي المرتبط بالشيخوخة. تحقيقا لهذه الغاية ، نستخدم مجموعة واسعة من التقنيات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية والهيكلية لاستكشاف الآليات الأساسية لشيخوخة الميتوكوندريا وتطوير التدخلات العلاجية للحفاظ على صحة الميتوكوندريا واستعادتها. ترتبط وظيفة الميتوكوندريا وهيكلها ارتباطا وثيقا.
تقنيات الفحص المجهري الضوئي القياسية مناسبة لقياس ميزات الميتوكوندريا على نطاق واسع مثل التشكل الأساسي وهياكل الشبكة. عادة ما يتم تحليل بنية الميتوكوندريا الفائقة أو الميزات التي تتطلب دقة أعلى مما يوفره الفحص المجهري الضوئي التقليدي باستخدام المجهر الإلكتروني أو التصوير المقطعي على عينات ثابتة. الفحص المجهري فائق الدقة هو تقنية تصوير قائمة على التألق تقيس الميزات التي تتجاوز حد الحيود.
بالنسبة للميتوكوندريا ، يتضمن ذلك قياسات توزيع البروتين على نطاق النانو وبنية cristae. يسمح بروتوكول التصوير المفصل هنا للباحثين بقياس البنية التفصيلية للغشاء الداخلي في الخلايا الحية. يسمح لنا التصوير الخلوي الحي بمراقبة وتحليل السمات المعقدة للكريستا كميا في ظل الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية دون الحاجة إلى تثبيت العينة.
سيعطي هذا الباحثين رؤى جديدة حول التغيرات الديناميكية التي تحدث في السمات الهيكلية الفائقة واستجاباتها الزمنية للضغوط والمركبات الدوائية.
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا لانتشار وتمايز وتلطيخ خلايا SH-SY5Y والخلايا العصبية المأخوذة من هضبة الحصين لدى الجرذان الأولية. الهدف هو تصور وتحليل البنية فوق الجزيئية للميتوكوندريا باستخدام مجهر الاستنزاف المثير (STED)، مما يوفر رؤى حول الديناميات الهيكلية للميتوكوندريا في الخلايا الحية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- بحوث الميتوكوندريا
الخلفية
- تعتبر بنية ووظيفة الميتوكوندريا حاسمة لصحة الخلية.
- يقتصر المجهر التقليدي في دقة تحليل البنية فوق الجزيئية.
- يتيح المجهر ذو الدقة العالية تصويرًا أكثر تفصيلًا لخصائص الميتوكوندريا.
- يمكن أن يوفر فهم التغيرات الميتوكوندريا رؤى حول الشيخوخة والخلل الوظيفي.
هدف الدراسة
- لتأسيس طريقة موثوقة لدراسة البنية فوق الجزيئية للميتوكوندريا في الخلايا الحية.
- لتمكين الباحثين من تحليل التغيرات الديناميكية في مورفولوجيا الميتوكوندريا.
- لتوفير أساس للتحقيق في استجابات الميتوكوندريا لمختلف العلاجات.
الطرق المستخدمة
- زراعة الخلايا وتمايز خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y.
- تحضير الخلايا العصبية المأخوذة من هضبة الحصين لدى الجرذان الأولية.
- استخدام مجهر STED للتصوير عالي الدقة.
- تشمل الخطوات الرئيسية إذابة الخلايا، وتغليف الشرائح، والتلطيخ بـ PKMO.
- اكتساب الصور وتحليلها من خلال برامج وإضافات محددة.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح للهياكل الميتوكوندريا بدقة النانومتر.
- رؤى حول بنية الكريستات وتوزيع البروتين داخل الميتوكوندريا.
- تحليل كمي للتغيرات في خصائص الميتوكوندريا تحت الظروف الفسيولوجية.
- نتائج محتملة هامة تتعلق باستجابة الميتوكوندريا للمركبات الدوائية.
الاستنتاجات
- توضح الدراسة تقنية قيّمة للتحقيق في ديناميات الميتوكوندريا في الخلايا الحية.
- تساهم في فهم دور الميتوكوندريا في الشيخوخة الخلوية والصحة.
- تأثيرات على التدخلات العلاجية التي تهدف إلى استعادة وظيفة الميتوكوندريا.
