قياس وظيفة الميتوكوندريا للخلايا التائية CD8 الساذجة والمستجيبة

يدرس مختبرنا التحمل المناعي والمراقبة المناعية وإشارات مستقبلات المستضد بواسطة الخلايا الليمفاوية. وجدنا أن حمض الليزوفوسفاتيديك يعطل السمية الخلوية للخلايا التائية CD8 مما يعزز التسامح المحيطي عن طريق تقليل المرونة الأيضية في الخلايا المستجيبة. نستخدم تقنيات لقياس استقلاب الميتوكوندريا وقدرات الطاقة في خلايا CD8 T.

أظهر مختبرنا أن حمض الليزوفوسفاتيديك يعدل اللياقة الأيضية لخلايا CD8 التائية وقد يكون محددا مهما للأنماط الظاهرية للخلايا التائية. يقوم بروتوكولنا الموصوف هنا بتقييم التمثيل الغذائي الوظيفي والطاقة الحيوية لإشارات مستقبلات الخلايا التائية في الوقت الفعلي. للبدء ، أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر في كل بئر من لوحة المرافق العامة.

ضع خرطوشة مستشعر أعلى لوحة المرافق ، مع التأكد من غمر نهايات خرطوشة المستشعر للسماح بالترطيب المناسب. احتضان لوحة المرافق بخرطوشة المستشعر عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 10 ساعات في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، املأ أنبوبا مخروطيا سعة 50 ملليلتر ب 50 مل من محلول العيار واحتضانه.

في اليوم التالي ، انقر فوق اللوحة لإزالة الماء المقطر. أعد ترطيب اللوحة ب 200 ميكرولتر من الفرجار. استبدل خرطوشة المستشعر أعلى لوحة المرافق وضع لوحة المرافق مرة أخرى في الحاضنة غير الخالية من ثاني أكسيد الكربون.

بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لإعادة تعليق 10 ملايين خلية CD8 T في 4.5 مل من الوسط الكامل. ماصة 90 ميكرولترا من التعليق لكل بئر متبوعة ب 90 ميكرولترا من الوسط المخصص لكل بئر أثناء المعالجة المسبقة. ماصة 180 ميكرولتر من الوسط الكامل في آبار الزاوية لمنع التبخر.

ثم ضع الصفيحة الدقيقة مع خلايا CD8 التائية في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون. ضع محولات اللوحة بإحكام على خرطوشة المستشعر. بعد الحضانة ، استخدم محولات الألواح لماصة Oligomycin و FCCP و Rotenone و Antimycin A في المنافذ المعنية.

ضع الصفيحة الدقيقة في الحاضنة غير ثاني أكسيد الكربون قبل ساعة واحدة من بدء الفحص. افتح البرنامج وقم بمعايرة محلل الجهاز قبل 30 دقيقة من تحميل الصفيحة الدقيقة. قم بتسمية الآبار ومراجعة مخطط الحقن في نظام البرنامج.

ثم قم بتحميل خرطوشة المستشعر في الجهاز أثناء المعايرة. قم بتشغيل الفحص من خلال البرنامج. بالنسبة للحقن الإضافية ، قم بتعديل مخططات الحقن باستخدام الغرفة الإضافية للحقن.

قم بتحميل مضاد CD3 ومضاد CD28 في المنفذ A لخرطوشة المستشعر. قم بتحميل Oligomycin في المنفذ B ، و FCCP في المنفذ C ، و Rotenone و Antimycin A في المنفذ D.بالنسبة للتحفيز الفردي المضاد ل CD3 ومضاد CD28 ، قم بإدخال 20 ميكرولترا من مضادات CD3 المضادة للبيوتينيل بمعدل 10 ميكروغرام لكل مليلتر في الآبار المخصصة لخرطوشة المستشعر. ماصة 20 ميكرولتر من مضاد CD28 والستربتافيدين في الآبار المخصصة.

للتحفيز المضاد ل CD3 أو CD28 ، قم بدمج وماصة 20 ميكرولترا من مضادات CD3 المضادة للبيوتينيل ، ومضاد CD28 ، والستربتافيدين في الآبار المخصصة. تحضير آبار التحكم عن طريق حقن الوسائط. للتحفيز المشترك المضاد ل CD3 و CD-28 ، استخدم حبة واحدة إلى واحد إلى نسبة الخلية وماصة خمسة ميكرولترات من الخرز المغناطيسي المضاد ل CD3 CD-28 في الآبار المعينة التي تحتوي على 200،000 خلية لكل بئر.

تحضير آبار التحكم بالوسائط للحقن فقط. اضبط السموم في كل منفذ لتحقيق تركيزات نهائية بعد الحقن. تأكد من أن مخطط الحقن يعكس النقاط الزمنية المحدثة قبل تحميل الصفيحة الدقيقة في الجهاز.

قم ببرمجة البرنامج لتشغيل مقايسة تحفيز TCR الحاد لمدة 140 دقيقة. قم بتعديل المخطط ليشمل 10 قياسات للنقاط الزمنية قبل حقن الأوليغومايسين. أدى التحفيز الحاد TCR باستخدام مضادات CD3 و / أو مضادة CD28 مع الستربتافيدين وتحفيز الخرزة المغناطيسية المضادة ل CD3 و / أو CD-28 إلى زيادة معدل استهلاك الأكسجين ومعدل التحمض خارج الخلية مقارنة بأدوات التحكم في الوسائط فقط.

أظهر تحفيز الخرزة المغناطيسية المضادة ل CD3 و CD-28 استجابات أيضية مماثلة لحقن مضادات CD3 و CD-28 البيوتينيل مع زيادات مماثلة في معدل استهلاك الأكسجين ومعدل التحمض خارج الخلية.