Name: تتبع إطلاق miRNA في الحويصلات خارج الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: اكتشف آليات تحميل microRNA في الحويصلات خارج الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي في خلايا Calu-6. تُقدّم هذه الطريقة رؤى حول استنزاف microRNA في السرطان.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن نقدر الدعم والمشورة من الدكتورة جيل هاتشكروفت ، مديرة المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي في جامعة بوردو. تم دعم هذا العمل من قبل R01CA226259 و R01CA205420 إلى A.L.K. ، وجائزة الابتكار من جمعية الرئة الأمريكية (ANALA2023) IA-1059916 إلى ALK ، ومنحة Purdue Shared Resources Facility P30CA023168 ، ومنحة فولبرايت للدكتوراه الرائدة التي منحتها وزارة الخارجية بالولايات المتحدة الأمريكية إلى H.H.H.

بروتوكول قياس التدفق الخلوي لفهم آليات التصدير

<ol><li>Kasinski, A. L., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+en+route+to+the+clinic%3A+Progress+in+validating+and+targeting+microRNAs+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+microRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).</li>
<li>Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FolamiRs%3A+Ligand-targeted%2C+vehicle-free+delivery+of+microRNAs+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer.</a> Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327(2017).</li>
<li>Orellana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+microRNA+activity+through+increased+endosomal+release+mediated+by+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin.</a> Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).</li>
<li>Abdelaal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first-in-class+fully+modified+version+of+miR-34a+with+outstanding+stability%2C+activity%2C+and+anti-tumor+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy.</a> Oncogene. , (2023).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles%3A+Apoptotic+bodies%2C+microvesicles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Hasan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+released+by+non-small+cell+lung+cancer+cells+drive+invasion+and+permeability+in+non-tumorigenic+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 972(2022).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Villarroya-Beltri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylated+hnRNPA2B1+controls+the+sorting+of+miRNAs+into+exosomes+through+binding+to+specific+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs.</a> Nature Communications. 4, 2980(2013).</li>
<li>Cha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS-dependent+sorting+of+miRNA+to+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes.</a> elife. 4, e07197(2015).</li>
<li>Gandham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+and+standardization+in+research+on+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Technologies and standardization in research on extracellular vesicles.</a> Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Sork, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+interplay+of+the+extracellular+vesicle+small+RNA+transcriptome+and+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10813(2018).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature Communications. 2, 282(2011).</li>
<li>Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+export+into+extracellular+vesicles+and+function+of+tRNA+fragments+during+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation.</a> Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).</li>
<li>Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-125b-5p+impacts+extracellular+vesicle+biogenesis%2C+trafficking%2C+and+EV+subpopulation+release+in+the+porcine+trophoblast+by+regulating+ESCRT-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway.</a> The FASEB Journal. 37 (8), e23054(2023).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يتيح البروتوكول الذي تم إنشاؤه حديثا التقاط حركية إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية بعد نقل EV-miRNAs. يسمح هذا النهج بالتحليل المتزامن للعديد من EV-miRNAs و cell-miRNAs ، وفقا لقدرات مقياس الخلايا. علاوة على ذلك ، في حين أن تحليل قياس التدفق الخلوي يمكن أن يوفر رؤى قيمة في بيولوجيا EV miRNA ، إلا أنه لا يخلو من القيود. وإن كان يمكن التغلب على بعض القيود عند استخدامها جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى لفهم أكثر شمولا. 
أحد مجالات الاهتمام الناشئة في بيولوجيا المركبات الكهربائية هو فهم التصدير الانت...

تعد MicroRNAs (miRNAs) واحدة من أفضل المجموعات الفرعية المميزة للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر ، والمعروفة بدورها الحاسم في تنظيم الجينات بعد النسخ. يتبع التعبير والتكوين الحيوي لمعظم miRNAs سلسلة منسقة من الأحداث التي تبدأ بنسخ miRNAs الأولية (pri-miRNAs) في النواة. بعد المعالجة النووية بواسطة مجمع المعالجات الدقيقة إلى سلائف miRNAs (pre-miRNAs) ، يتم تصدير ما قبل miRNAs إلى السيتوبلازم ، حيث تخضع لمزيد من المعالجة بواسطة RNase III endonuclease ، dicer إلى 21-23 نيوكليوتيدات ناضجة miRNAدوبلكس 1. يرتبط أحد خيوط miRNA الناضجة المعالجة بالحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) ، مما يؤدي إلى تدهور أو قمع متعدية للأهداف2. استنادا إلى الدور متعدد الخواص ل miRNAs في تنظيم العديد من mRNAs المستهدفة المتنوعة في وقت واحد ، فليس من المستغرب أن يتم تنظيم تعبير miRNA بإحكام3. في الواقع ، يساهم التعبير غير المناسب في حالات مرضية مختلفة ، خاصة في السرطان. لا يمثل التعبير الشاذ عن miRNAs توقيعا خاصا بالمرض فحسب ، بل ظهر أيضا كهدف للإمكانات النذير والعلاجية4،5،6. بالإضافة إلى أدوارها داخل الخلايا ، فإن miRNAs لها أيضا أدوار غير مستقلة. على سبيل المثال ، يمكن تعبئة miRNAs بشكل انتقائي في EVs بواسطة الخلايا المانحة وتصديرها إلى المواقع المتلقية حيث تثير استجابات مظهرية متنوعة في علم وظائف الأعضاء الطبيعي والمرض7،8،9.
على الرغم من الأدلة الواضحة على أن miRNAs المرتبطة ب EV هي جزيئات حيوية وظيفية ، إلا أنه ليس من المفهوم تماما كيف يتم تنظيم مجموعات فرعية معينة من miRNAs في حالات المرض مثل السرطان وكيف تختار الآلية الخلوية وفرز miRNAs إلى Evs10,11. بالنظر إلى الدور المحتمل ل EV-miRNAs في تعديل البيئة المكروية ، من الأهمية بمكان تحديد الآليات التي ينطوي عليها تصدير miRNAs المختارة لتوضيح دور المركبات الكهربائية بشكل كامل في الاتصال بين الخلايا والتسبب في المرض. إن فهم عملية إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية لن يسلط الضوء على الوسطاء المهمين لتصدير miRNA فحسب ، بل يمكن أن يوفر أيضا رؤى حول العلاجات المحتملة. لتحقيق هذا المستوى من المعرفة ، يجب تكييف الأدوات لمعالجة هذه الأسئلة التجريبية الجديدة بأمانة. في الواقع ، تنمو الدراسات التي تقيم المركبات الكهربائية بشكل كبير بسبب إدخال تقنيات وضوابط جديدة12,13. فيما يتعلق بتقييم وفرة miRNAs المصدرة إلى EVs ، كان تسلسل الجيل التالي وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) هي الأدوات القياسية الحالية. في حين أن هذه الأدوات مفيدة لتقييم وفرة miRNAs في المركبات الكهربائية ، إلا أن هناك قيودا على حساسيتها وخصوصيتها ، واستخدام هذه الأساليب الثابتة لتقييم الديناميكيات غير كاف. يتطلب تحديد ديناميكيات تصدير miRNA إلى المركبات الكهربائية مجموعة من الأدوات المتخصصة. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا باستخدام miRNAs المترافقة بالفلورسنت ، لتحليل ديناميكيات إطلاق miRNA من الخلايا المانحة ودمجها في EVs. نناقش أيضا مزايا وقيود الطريقة ونقدم توصيات للاستخدام الأمثل. ستكون الطريقة متعددة الاستخدامات المقدمة في هذه الورقة مفيدة للباحثين المهتمين بدراسة إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية وأدوارها المحتملة في الاتصالات الخلوية والمرض.

أنابيب <table><tbody><tr><td>أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل</td><td>فيشر</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب فالكون سعة 15 مل</td><td>من ألواح</td> زراعة الأنسجة المعالجة ذات <td>352097 القاع</td><td></td></tr> المسطح 6 <tr><td>آبار</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>ApogeeMix 25 مل ، (PS80 / 110/500 & amp; Si180/240/300/590/880/1300 نانومتر) &nbsp;</td><td>Apogee Flow Systems</td><td>1527</td><td>لإعداد البوابات والمعلمات للكشف عن الجسيمات &nbsp ؛</td></tr><tr><td>Attune Nxt Flow Cellular</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N / A</td><td>لتحليل التألق في EVs</td></tr><tr><td>BD Fortessa Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>N / A</td><td>لتحليل التألق في الخلايا &nbsp ؛</td></tr><tr><td>حاضنة ثقافة الخلية</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>الحفاظ على درجة حرارة 37 &nbsp ؛ &deg; C و 5٪ CO2</td></tr> <tr><td>وسط ثقافة الخلية</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>خاص لخط الخلية ذات الأهمية</td></tr><tr><td>خط الخلية ذي الاهتمام&nbsp;</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>أي خط خلوي تم اختباره وتقييمه من حيث الوفرة الخلوية والوفرة الخلوية من miRNAs عند الفائدة.</td></tr><tr><td>Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Micic Red Transfection Control)</td><td>اكتشاف الأفق</td><td>CP-004500-01-05</td><td>miRNAs المحددة مسبقا للاحتفاظ بها بواسطة خط الخلية ذي الأهمية وعدم تصديرها بشكل انتقائي إلى EVs</td></tr><tr><td>EV-miRNA (miRNAs المترافقة بالفلوروفور) تقنيات</td> <td>الحمض النووي المتكاملة (IDT)</td><td></td> <td>miRNAs المحددة مسبقا ليتم فرزها بشكل انتقائي إلى EVs & nbsp ؛</td></tr><tr><td>مجهر مضان</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO OPTI-MEM مصل متوسط</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>31-985-070</td><td></td></tr><tr><td>مقياس الدم العلمي</td><td>هوسر فيشر</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 1x PBS (لزراعة الخلايا)</td><td>فيشر</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>ليبوفاكتامين RNAimax</td><td>فيشر Scientific</td><td>13-778-150</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA Reverse Transcriptase</td><td>Qiagen</td><td>339340</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA SYBR Green PCR</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>339347</td><td></td></tr><tr><td>mirVana RNA Isolation</td><td>Qiagen</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>مياه خالية من النوكليز</td><td>فيشر Scientific</td><td>4387936</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde ، 4٪ في PBS</td><td>Fisher</td><td>AAJ61899AK</td><td></td></tr><tr><td>كاشف خزان غير معقم</td><td>VWR</td><td>89094-684</td><td></td></tr><tr><td>Thermo ABI QuantiStudio DX في الوقت الحقيقي PCR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>التربسين 0.25٪</td><td>فيشر&nbsp;</td><td>SH3004201</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي فائق</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

تتبع إطلاق mirna في الحويصلات خارج الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي

Tracking miRNA Release into Extracellular Vesicles using Flow Cytometry

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي وسطاء مهمون للاتصال الخلوي الذي تفرزه مجموعة متنوعة من الخلايا المختلفة. تنقل هذه المركبات الكهربائية الجزيئات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك البروتينات والدهون والأحماض النووية (الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي المرسال ، والحمض النووي الريبي الدقيق ، وغيرها من الحمض النووي الريبي غير المشفر) ، من خلية إلى أخرى ، مما يؤدي إلى عواقب النمط الظاهري في الخلايا المتلقية. من بين جميع شحنات EV المختلفة ، حظيت microRNAs (miRNAs) بقدر كبير من الاهتمام لدورها في تشكيل البيئة المكروية وفي تثقيف الخلايا المتلقية بسبب عدم تنظيمها الواضح ووفرة في المركبات الكهربائية. تشير البيانات الإضافية إلى أن العديد من miRNAs يتم تحميلها بنشاط في المركبات الكهربائية. على الرغم من هذا الدليل الواضح ، فإن البحث عن ديناميكيات التصدير وآليات فرز miRNA محدود. هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي ل EV-miRNA والذي يمكن استخدامه لفهم ديناميكيات تحميل EV-miRNA وتحديد الآلات المشاركة في تصدير miRNA. في هذا البروتوكول ، يتم اقتران miRNAs المحددة مسبقا ليتم تخصيبها في EVs واستنفادها من الخلايا المانحة إلى فلوروفور ونقلها إلى الخلايا المانحة. ثم يتم التحقق من miRNAs الموسومة بالفلورسنت للتحميل في EVs والنضوب من الخلايا باستخدام qRT-PCR. كعنصر تحكم في النقل وأداة لبوابة السكان المنقولين من الخلايا ، يتم تضمين الحمض النووي الريبي الخلوي المسمى بالفلورسنت (الخلايا المحتفظ بها والمستنفدة EV). يتم تقييم الخلايا المنقولة مع كل من EV-miRNA والخلية المحتفظ بها miRNA لإشارات الفلورسنت على مدار 72 ساعة. تتضاءل شدة إشارة التألق الخاصة ب EV-miRNAs بسرعة مقارنة بالحمض النووي الريبي المرسال المحتفظ به بالخلية. باستخدام هذا البروتوكول المباشر ، يمكن للمرء الآن تقييم ديناميكيات تحميل miRNA وتحديد العوامل المختلفة المسؤولة عن تحميل miRNAs في المركبات الكهربائية.

هنا ، نستخدم قياس التدفق الخلوي كأداة قوية للتحقيق في إطلاق miRNA من الخلايا إلى EVs. باستخدام هذا البروتوكول ، كشف تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا المنقولة باستخدام cell-miRNA و EV-miRNA عن انخفاض متسلسل في إشارة التألق المقابلة ل EV-miRNA ، بينما تم الاحتفاظ بالإشارة المقابلة ل cell-miRNA في الخلايا. للتأكد من أن اقتران الفلوروفور لا يتداخل مع إطلاق miRNA في EVs ، تم اقتران miR-451a إلى فلوروفورين منفصلين (أي Alexa fluor 488 و Alexa fluor 750) ، وتم تقييم احتباس الخلايا. تشير النتائج إلى الحد الأدنى من التباين بين اكت...

هنا ، نصف بروتوكولا مباشرا يتيح التقييم في المختبر لوفرة الحمض النووي الريبي الميكروي المسمى بالفلورسنت لدراسة ديناميكيات تغليف microRNA وتصديره إلى حويصلات خارج الخلية (EVs).

تتبع إطلاق miRNA في الحويصلات خارج الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle ...

يعمل مختبري على دراسة الحمض النووي الريبي الميكروي ، وقد عرفنا منذ عقود أن الحمض النووي الريبي الميكروي مستنفد في السرطان. ومع ذلك ، فإن الآلية المتعلقة بكيفية فقدان هذه الحمض النووي الريبي الصغير لم يتم فهمها بنشاط. يشير عملنا الأخير على الحويصلات خارج الخلية إلى أن الحمض النووي الريبي الدقيق المستنفد في السرطان يتم تحميله بنشاط في هذه الحويصلات خارج الخلية.هدفنا الآن هو الوصول حقا إلى آلية كيفية تحميل هذه الحمض النووي الريبي بنشاط في هذه الحويصلات خارج الخلية في عملية نشأة الورم. يساعد البروتوكول على فهم والتقاط العملية الديناميكية لإطلاق الحمض النووي الريبي الدقيق في الحويصلات خارج الخلية ، والتي تعد واحدة من المجالات الصعبة في دراسة بيولوجيا الحويصلة خارج الخلية. توفر النتائج التي توصلنا إليها أداة لتطوير دراسة المسارات التي تنظم استنفاد الحمض النووي الريبي الصغير في السرطان.نحن نخطط لتحديد العواقب الوظيفية والظاهرية لفقدان مجموعات فرعية محددة من microRNA عبر الحويصلات خارج الخلية في السرطان. بمجرد تحديد العوامل التي تشارك في تحميل هذه الحمض النووي الريبوزي الدقيق في حويصلات خارج الخلية ، فإن هدفنا هو تقليل تنظيم هذه العوامل وتقييم نتيجة النمط الظاهري. علاوة على ذلك، نظرا لأننا حددنا فكرة موجودة في هذه الحمض النووي الريبوزي الصغير، فإننا نشعر بالفضول لمعرفة ما إذا كان هذا الشكل ضروريا وكافيا لتحميل هذه الحمض النووي الريبوزي (RNA) في الحويصلات خارج الخلية.

tracking-mirna-release-into-extracellular-vesicles-using-flow

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الفيديو التقاط المناعة للحويصلات خارج الخلية باستخدام اقتران الجسيمات النانوية المغناطيسية للأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت. تتضمن العملية تكوينا معقدا ، وتلوين بأجسام مضادة للكشف المسمى بالفلورسنت ، والفصل المغناطيسي ، وتحليل التدفق الخلوي لتوصيف المستضد.

الالتقاط المناعي وقياس التدفق الخلوي للحويصلات خارج الخلية لتوصيف المستضدات

وجود العديد من الطرق المختلفة لقياس الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) باستخدام التدفق الخلوي (FCM). وينبغي النظر في العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. يتم عرض بروتوكولين لقياس المركبات الكهربائية، وذلك باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة.

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

تم التقاط الفيروسات أو الحويصلات خارج الخلية بخلايا نانوية مغناطيسية 15 نانومتر مقترنة بالأجسام المضادة التي تتعرف على المستضدات السطحية. تم تصنيف الفيروسات أو الحويصلات التي تم التقاطها بأجسام مضادة فلورية ضد مستضدات سطحية أخرى. تم فصل المجمعات الناتجة في مجال مغناطيسي عال وتحليلها باستخدام مقاييس التدفق الخلوي التقليدية التي يتم تشغيلها عند التألق.

تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات

هنا، نحن تصف تطبيق الانتعاش مضان ثلاثي الأبعاد بعد فوتوبلاشينغ (3D-فراب) لتحليل الفجوة تقاطع تعتمد على مكوك من ميرنا. على النقيض من الأساليب المطبقة عادة، 3D-فراب يسمح لكمية النقل بين الخلايا من الحمض النووي الريبي الصغيرة في الوقت الحقيقي، مع ارتفاع القرار المكاني والزماني.

تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

في هذا البروتوكول، يصف لنا إكمال سير العمل لعزل السريع من حويصلات خارج الخلية من دماء كل البشر وتوصيف علامات محددة بتحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار. إظهار درجة عالية من إمكانية تكرار نتائج النتائج المعروضة ويمكن تعديلها ل supernatants ثقافة الخلية.

توصيف واحد حويصلات خارج الخلية في الدم البشري مع تحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار السريع

البروتوكول وصف أسلوب استنساخه مصممة للاستخدام مع supernatants ثقافة الخلية للكشف عن سطح [ابيتوبس] في حويصلات صغيرة خارج الخلية (EV). فإنه يستخدم إيمونوبريسيبيتيشن EV محددة باستخدام الخرز مقترنة بالأجسام المضادة التي تعترف بسطح مستضد CD9، CD63، و CD81. الأسلوب هو الأمثل للتحليل الخلوي تدفق المتلقين للمعلومات.

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

تساهم الحويصلات خارج الخلية (EVs) في البيولوجيا الخلوية والاتصالات بين الخلايا. هناك حاجة إلى إجراء فحوصات عملية لتصور وقياس امتصاص المركبات الكهربائية من قبل الخلايا. يقترح البروتوكول الحالي فحص امتصاص EV من خلال استخدام التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد عبر المجهر الكونفوكوكال ، بعد عزل EV بواسطة جهاز microfluidic قائم على الترشيح النانوي.

خارج الخلية Vesicle امتصاص المقايسة عبر تحليل التصوير المجهر Confocal

أحدث جيل من أدوات توصيف EV قادرة على تحليل EV واحد عبر معلمات متعددة في وقت واحد. يقيس قياس التدفق الخلوي النانوي جميع الجسيمات البيولوجية التي يزيد حجمها عن 45 نانومتر دون وضع العلامات ويحدد الخصائص المحددة للسكان الفرعيين من خلال مجموعة متنوعة من تقنيات وضع العلامات الفلورية.

توصيف البروتين عبر الغشاء الحويصلة خارج الخلية بواسطة قياس التدفق الخلوي النانوي

يوفر هذا البروتوكول وصفا تفصيليا لفرز الحويصلات خارج الخلية (EVs) التي تطلقها الخلايا اللحمية الوسيطة. على وجه الخصوص ، يركز على إعداد الأداة وتحسين ظروف الفرز. الهدف هو فرز الحويصلات خارج الخلية مع الحفاظ على خصائصها.

إعداد فرز ناجح لعزل الحويصلة خارج الخلية

هنا ، نضع بروتوكولا باستخدام كميات قليلة من أقسام أنسجة المخ المجمدة حديثا وطريقة طرد مركزي عالية السرعة يمكن الوصول إليها إلى جانب كروماتوغرافيا استبعاد الحجم للحصول على حويصلات صغيرة خارج الخلية كمصادر للمؤشرات الحيوية microRNA (miRNA) للاضطرابات العصبية.

تسخير قوة شحنات الحمض النووي الريبي الصغير في حويصلات صغيرة خارج الخلية يتم إطلاقها من أقسام الدماغ البشري المجمدة حديثا 

اكتشف آليات تحميل microRNA في الحويصلات خارج الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي في خلايا Calu-6. تُقدّم هذه الطريقة رؤى حول استنزاف microRNA في السرطان.

تتبع إطلاق miRNA في الحويصلات خارج الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي

استكشف المزيد من الفيديوهات