Name: الحقن داخل القراب للفأر حديث الولادة لتحرير الجينوم وتوصيل الدواء (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: تعلم تقنية الحقن داخل القراب للفأر حديث الولادة لتحرير الجينوم وتوصيل الدواء مباشرة إلى الجهاز العصبي المركزي. هذه الطريقة تُحسّن سلامة العلاجات وتزيد من كفاءة التحرير الجيني في نماذج الاضطرابات العصبية التنموية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

يتم دعم XNL من قبل مؤسسة زمالة ما بعد الدكتوراه العلاجية لمتلازمة أنجلمان (FAST). YHJ هو أيضا دعم من قبل FAST و NIH Grant R01HD110195 و R01MH117289.

كانت الإجراءات والبروتوكولات الموصوفة متوافقة مع المبادئ التوجيهية الموضحة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، حصلت الإجراءات على موافقة من لجنة رعاية واستخدام في كلية الطب بجامعة ييل. تم استخدام ذكور وإناث الفئران من النوع البري (WT) C57BL / 6J في الدراسة المقدمة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. إعداد مساحة العمل
<ol><li>قم بإعداد العناصر التالية أولا: ثلج رطب للتخدير بالتبريد ، وقفص فارغ لفصل الجراء عن السد ، ومجهر تشريح ، ومصدر ضوء ، وسطح نظيف لوضع أثناء الحقن ، ومسحات قطنية ، ووسادة تدفئة ، وحقنة 25/10 ميكرولتر ، وإبرة 34 جم / 0.375 بوصة / 12 درجة (انظر جدول المواد). ملاحظة: يعد التخدير بالتبريد لجراء الفئران باستخدام الثلج الرطب خطوة اختيارية تهدف إلى تسهيل المناولة وتقليل حركة الجراء وتقليل الانزعاج المحتمل للحيوانات. قد توفر خطوة التخدير بالتبريد هذه أيضا فائدة خفض الضغط داخل الجمجمة وتقليل المضاعفات المرتبطة بالحجم 9,10.</li>
	<li>انقل الجراء إلى قفص منفصل بعيدا عن السد أثناء التعامل معهم.</li>
	<li>وزن كل جرو وتوثيق وزنه.</li>
	<li>امسح الجزء الخلفي من الماوس باستخدام الشاش والإيثانول. تأكد من المساحة الفقرية أو ، على الأقل ، خط الوسط للقناة الشوكية (التي يجب أن تظهر حمراء في الجراء P1) باستخدام المجهر التشريحي (الفيديو التكميلي 1).</li>
</ol>2. إجراء الحقن
<ol><li>لتخدير جرو واحد ، ضعه برفق على حاجز مقاوم للماء مثل غلاف اللاتكس أو ورق الألمنيوم في حمام جليدي لمدة 3-5 دقائق. من المهم تجنب ترك على الجليد لفترة طويلة ، لأن القيام بذلك قد يشكل مخاطر محتملة للمضاعفات المرتبطة بانخفاض حرارة الجسم ، بما في ذلك الرجفان البطيني ونقص الأكسجة في الأنسجة والحماض الأيضي. ملاحظة: قد تختلف مدة 3-5 دقائق على أساس كل حالة على حدة. قم بتقييم علامات التخدير، مثل عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم، لتحديد المدة المناسبة.</li>
	<li>أثناء وجود على الجليد ، قم بتحميل المحقنة ب 10 ميكرولتر من تركيبة الدواء ، أو تحضير الفيروس ، أو التحكم في السائل الشوكي الاصطناعي ، إلخ. ملاحظة: أثناء مرحلة التعلم ، ضع في اعتبارك خيار حقن نفس الحجم من صبغة Fast Green المختلطة بنسبة 1٪ مع مواد التوصيل (انظر جدول المواد). يمكن أن يساعد ذلك في تصور عملية الحقن والمساعدة في تعلم التقنية وتحسينها. يجب القتل الرحيم للجراء المحقونة بالصبغة الخضراء السريعة أو مواد مماثلة بعد فترة وجيزة من الحقن وفقا للبروتوكول المعتمد ، لأن هذه المواد قد تؤدي إلى تفاعلات التهابية أو آثار جانبية أخرى في.</li>
	<li>بمجرد تخدير بالكامل ، كما يتضح من انخفاض حركة الجسم أو غيابها ، ضع الجراء برفق تحت المجهر.</li>
	<li>باستخدام السبابة والإبهام الأيسر، قم بتحسس المساحة الفقرية بعناية على طول خط الوسط، وتقع بين أحزمة الحوض الثنائية (الفيديو التكميلي 1). قم بتدوير قاعدة الذيل برفق قليلا للمساعدة في تحديد خط الوسط للعمود الفقري.</li>
	<li>ضبط شطبة الإبرة نحو رأس قبل الحقن.</li>
	<li>أدخل الإبرة بعناية ، وقم بإمالتها قليلا إلى زاوية 70 درجة -80 درجة عند النقطة التي تتقاطع فيها المسافة البادئة ، مع التأكد من بقاء المحقنة محاذاة مع المستوى السهمي المركزي. عندما تتلامس الإبرة مع العظم ، قم بتقليل الزاوية تدريجيا إلى حوالي 30 درجة ، ثم ادفع الإبرة حوالي 2 مم في الفضاء الفقري. ملاحظة: قدرة الإبرة على رفع الجسم بالكامل قليلا هي علامة على الدخول الناجح إلى الفضاء داخل الجافية.</li>
	<li>حقن ببطء ما يصل إلى 10 ميكرولتر حجم في غضون 50-60 ثانية. حافظ على الإبرة في مكانها لمدة 10-20 ثانية بعد اكتمال الولادة. اسحب الإبرة بتدوير لطيف لتجنب التسرب. ملاحظة: سيتحول المخيخ إلى اللون الأخضر قبل سحب الإبرة. أيضا ، يعد الدفع البطيء أمرا بالغ الأهمية لمنع زيادة الضغط داخل الجمجمة المرتبط بالولادة وتقليل المضاعفات المحتملة. بناء على خبرتنا مع الحقن في أكثر من 500 جرو ، فإن تقديم حجم 10 ميكرولتر يزيد عن 50-60 ثانية هو الأمثل.</li>
</ol>3. بعد الحقن
<ol><li>ضع قطعة قطن على موقع الحقن إذا كان هناك أي تسرب أو دم. ملاحظة: لا ينبغي أن يكون هناك أي في معظم الحالات. من تجربتنا ، لا تزال الجراء المعالجة بآثار تسرب أو دم قابلة للاستخدام ، ولكن قد يكون من الضروري النظر في جرعة مخفضة من الأدوية أو العلاجات أثناء تحليل البيانات.</li>
	<li>ضع الجرو على وسادة تدفئة واترك 10-15 دقيقة حتى تتعافى الجراء تماما وتعيد التدفئة. راقب الجراء بعناية للتأكد من أنهم في حالة تأهب ويتحركون بنشاط قبل إعادتهم إلى قفصهم المنزلي. يشار إلى الانتعاش الكافي للماوس من خلال استعادة لون البشرة الوردي ، وزيادة حركة الجسم التلقائية ، وردود الفعل المستجيبة للمس.</li>
	<li>ضع الجرو مرة أخرى في قفص المنزل وتأكد من تغطية الجرو بشكل صحيح بالفراش أو نستله أو كليهما. هذا يضمن أن الجرو يتلقى رعاية الأم اللازمة من السد.</li>
	<li>تقييم المظهر العام والنشاط يوميا لمدة 3 أيام على الأقل بعد الحقن. قد يؤدي ظهور المرض وانخفاض النشاط إلى زيادة احتمال الإصابة بالعدوى أو الآثار الجانبية المرتبطة بالعلاج أو المضاعفات الأخرى ، إلخ. إذا لزم الأمر ، استشر الرعاية البيطرية.</li>
</ol>

بروتوكول شامل لتوصيل الحقن داخل القراب في الفئران حديثي الولادة

<ol><li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onasemnogene+abeparvovec%3A+first+global+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Onasemnogene abeparvovec: first global approval.</a> Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).</li>
<li>Ramos, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+SMN+expression+in+disease-relevant+tissue+and+implications+for+SMA+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment.</a> J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).</li>
<li>Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+delivery+to+CNS+by+spinal+intrathecal+administration+to+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice.</a> J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).</li>
<li>Dindot, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ASO+therapy+for+Angelman+syndrome+that+targets+an+evolutionarily+conserved+region+at+the+start+of+the+UBE3A-AS+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript.</a> Sci Transl Med. 15, eabf4077(2023).</li>
<li>Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotide+therapy+for+the+nervous+system%3A+from+bench+to+bedside+with+emphasis+on+pediatric+neurology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology.</a> Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).</li>
<li>Frangoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+editing+for+sickle+cell+disease+and+%CE%B2-Thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia.</a> N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).</li>
<li>Gillmore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+in+vivo+gene+editing+for+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis.</a> N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).</li>
<li>Krol, A., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windows+of+opportunity%3A+timing+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders.</a> Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).</li>
<li>Birg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+temperature+influences+intracranial+pressure+and+cerebral+perfusion+pressure+after+traumatic+brain+injury%3A+A+CENTER-TBI+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocrit+Care%22%5BJournal%5D)">Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study.</a> Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).</li>
<li>Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+temperature%2C+body+core+temperature%2C+and+intracranial+pressure+in+acute+cerebral+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. 91, e51863(2014).</li>
<li>Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+II+clinical+trial+with+repeated+intrathecal+injections+of+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+patients+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).</li>
<li>Kroin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+intracranial+pressure+modulation+by+epidural+blood+and+other+injectates+in+a+postdural+puncture+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model.</a> Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).</li>
<li>Møllgård, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesothelium+divides+the+subarachnoid+space+into+functional+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments.</a> Science. 379 (6627), 84-88 (2023).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PLoS One. 8, e67680(2013).</li>
<li>Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+development+in+rodents+and+humans%3A+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).</li>
</ol>

YHJ هو أحد مؤسسي Couragene ولكن لا يوجد تضارب في المصالح لهذا المشروع.

الموصوف هو إجراء خطوة بخطوة للحقن داخل القراب في الفئران حديثي الولادة (P1) ، مما يؤدي إلى توزيع الأدوية على نطاق واسع في أدمغتهم. بالمقارنة مع طريقة الحقن داخل المخ البطيني الشائعة لتوصيل الدواء إلى الفئران حديثي الولادة ، والتي تتضمن ثقب القشرة الدماغية11 ، فإن الحقن داخل القراب يتجنب الإصابة المباشرة لدماغ الفأر الوليدي بسبب اختراق الإبرة. بسبب الحد الأدنى من الغزو ، يمكن إجراء الحقن داخل القراب بشكل متكرر عند الضرورة ، ومحاكاة الإدارات المتكررة في البشر في بيئة سريرية12...

الحقن داخل القراب (IT) هو إجراء سريري شائع يستخدم لإدارة الأدوية ، وجمع السائل النخاعي ، والحفاظ على الضغط داخل الجمجمة في كل من المرضى الأطفال والبالغين في العيادات1،2. يعد إعطاء الأدوية عن طريق الحقن داخل القراب طريقة فعالة لزيادة تركيزات الأدوية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع تقليل التعرض الجهازي. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تعزز الفعالية العلاجية وتقلل من الآثار الجانبية ، خاصة بالنسبة للأدوية الحساسة للحرارة وقصيرة العمر3.
في الدراسات قبل السريرية التي تختبر عقاقير وعلاجات جديدة باستخدام نماذج القوارض ، من الضروري استخدام طريقة موثوقة لإدارة الأدوية توفر دقة أكبر وقابلية استنساخالنتائج 4,5. بالنسبة للدراسات قبل السريرية التي تقيم العلاجات الجديدة للاضطرابات العصبية الوراثية واضطرابات النمو العصبي ، يعد العلاج المبكر أمرا بالغ الأهمية لدراسات إثبات المفهوم الأولية لأنه من المتوقع عادة أن تسفر التدخلات السابقة عن نتائج أكثر ملاءمة6،7،8.
بالمقارنة مع الحقن التقليدية داخل بطانة الرحم البطينية (ICV) ، فإن حقن تكنولوجيا المعلومات تحمل مخاطر أقل بكثير لأنها تتجنب الحاجة إلى الاختراق المباشر من خلال القشرة الدماغية. هذه الميزة تقلل بشكل كبير من الضرر المحتمل للأنسجة القشرية الإقليمية والأعصاب المحيطة. علاوة على ذلك ، تسمح حقن تكنولوجيا المعلومات بزيادة خمسة أضعاف على الأقل في الحجم القابل للإدارة من الأدوية من خلال حقنة واحدة ، مما يعزز بشكل كبير جدوى الإدارات المتكررة. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجم الفئران حديثي الولادة وطبيعتها الهشة ، فإن إجراء الحقن داخل القراب في الجراء حديثي الولادة يمثل تحديا تقنيا ويتطلب تقنيات ومعدات متخصصة ومعالجة دقيقة.
توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا مع إرشادات خطوة بخطوة لإجراء الحقن داخل القراب في الجراء حديثي الولادة P1. يتم التأكيد هنا على الاعتبارات الرئيسية والممارسات المختبرية الجيدة لضمان اتساق الإدارة وسلامة ورفاهية أثناء الإجراء. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين إجراء تجارب بثقة بدقة وقابلية للتكرار مع تقليل أي مخاطر محتملة أو إزعاج للحيوانات.

<table><tbody><tr><td>بالانس</td><td>أوهاوس كوربوريشن</td><td>30253017</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J</td> الفئران <td>مختبر جاكسون</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>المجهر الرقمي</td><td>RWD</td><td>DOM-1001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>وسادة تسخين سريعة خضراء</td><td>سيجما</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RWD</td><td>69020</td><td></td></tr><tr><td>إبر</td><td>هاميلتون</td><td>6PK (34 / 0.375 "/ 4 / 12DEG) S</td><td></td></tr><tr><td>حقنة</td><td>هاميلتون</td><td>1702RN</td><td></td></tr><tr><td>مرشحات حقنة</td><td>سيجما</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

الحقن داخل القراب للفأر حديث الولادة لتحرير الجينوم وتوصيل الدواء

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

الحقن داخل القراب هو إجراء شائع الاستخدام في كل من عيادات الأطفال والبالغين ، ويعمل كوسيلة فعالة لإدارة الأدوية والعلاجات. من خلال توصيل الأدوية والعلاجات مباشرة إلى السائل النخاعي للجهاز العصبي المركزي ، تحقق هذه الطريقة تركيزات أعلى من الأدوية الموضعية مع تقليل الآثار الجانبية الجهازية مقارنة بالطرق الأخرى مثل الحقن في الوريد أو تحت الجلد أو الحقن العضلي. تمتد أهميته إلى ما هو أبعد من الإعدادات السريرية ، حيث يلعب الحقن داخل القراب دورا حيويا في الدراسات قبل السريرية التي تركز على علاج الاضطرابات العصبية الوراثية في القوارض الكبيرة الأخرى ، بما في ذلك الرئيسيات غير البشرية. ومع ذلك ، على الرغم من تطبيقه على نطاق واسع ، فإن الحقن داخل القراب في الصغار ، وخاصة الجراء حديثي الولادة ، يشكل تحديات تقنية كبيرة بسبب صغر حجمها وطبيعتها الهشة. تتطلب الإدارة الناجحة والموثوقة للحقن داخل القراب في الفئران حديثي الولادة اهتماما دقيقا بالتفاصيل ودراسة متأنية للعوامل المختلفة. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى بروتوكول موحد لا يوفر التعليمات فحسب ، بل يسلط الضوء أيضا على الاعتبارات الفنية الرئيسية والممارسات المختبرية الجيدة لضمان الاتساق الإجرائي ، فضلا عن سلامة ورفاهها.
لتلبية هذه الحاجة غير الملباة ، نقدم بروتوكولا مفصلا وشاملا لإجراء الحقن داخل القراب على وجه التحديد في الجراء حديثي الولادة في اليوم الأول بعد الولادة (P1). باتباع التعليمات خطوة بخطوة ، يمكن للباحثين إجراء الحقن داخل القراب بثقة في الجراء حديثي الولادة ، مما يتيح التوصيل الدقيق للأدوية ، و oligos المضادة للحساسية ، والفيروسات لاستبدال الجينات أو العلاجات القائمة على تحرير الجينوم. علاوة على ذلك ، يتم التأكيد على أهمية الالتزام بالممارسات المختبرية الجيدة للحفاظ على رفاهية وضمان نتائج تجريبية موثوقة. يهدف هذا البروتوكول إلى معالجة التحديات التقنية المرتبطة بالحقن داخل القراب في الفئران حديثي الولادة ، مما يسهل في نهاية المطاف التقدم في مجال البحوث الوراثية العصبية التي تهدف إلى تطوير التدخلات العلاجية المحتملة.

أدى الحقن الناجح داخل القراب على الفور إلى توزيع واسع النطاق للمحلول الذي يتم إعطاؤه ، على الرغم من أن الاختراق الخلوي الفعلي يعتمد على طبيعة الأدوية والمواد التي يتم تسليمها. في هذه الدراسة ، استخدمنا Fast Green لتصور النتائج الفورية بعد الحقن داخل القراب (IT) في حديثي الولادة من النوع البري (الشكل 1A-K) ومقارنتها بالحقن التقليدي داخل المخ البطيني (ICV) (الشكل 1L-N). كما تم فحص النتائج طويلة ال...

يحدد هذا البروتوكول تعليمات خطوة بخطوة لإجراء الحقن داخل القراب في الفئران الوليدية لتحرير الجينات وتوصيل الأدوية.

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...

تستخدم مجموعتنا نهجا متعدد التخصصات يتضمن اكتشاف الجينوم والنمذجة الوظيفية لدراسة علم الوراثة والأساس اللاجيني لاضطراب النمو العصبي. نقوم بإجراء التحليل الجزيئي والفسيولوجي العصبي والسلوكي العصبي باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها المريض ، أو iPSC ، في الفئران الطافرة لتشريح الفيزيولوجيا المرضية لاضطراب النمو العصبي. نحن نهدف إلى تطوير علاج قائم على تحرير الجينات لهذا المرض.الحقن داخل بطانة الرحم البطينية ، ويسمى أيضا ICV ، هو الطريقة الوحيدة لتقديم العلاج مباشرة إلى الجهاز العصبي المركزي للفئران حديثي الولادة. ومع ذلك ، يجب أن تخترق القشرة الدماغية. الحقن داخل القراب ، تكنولوجيا المعلومات ، هو إجراء شائع الاستخدام في العيادات ، ويعمل كوسيلة فعالة لإدارة العلاجات مباشرة في الجهاز العصبي المركزي.ومع ذلك ، يمكن أن يشكل الحقن داخل القراب في الجراء حديثي الولادة تحديات تقنية كبيرة بسبب صغر حجمها وطبيعتها الهشة. نحن نحاول تطوير طريقة توصيل فعالة وموثوقة لاختبار الفعالية وتحرير الجينات في دماغ الفأر غير الفيروسي وغير النانوي. بالمقارنة مع حقن ICV التقليدي ، يمثل الحقن داخل القراب خطرا أقل بكثير ، لأنه يتجنب الحاجة إلى الاختراق المباشر من خلال القشرة الدماغية.هذا يضيف ميزة لتقليل الضرر المحتمل للأنسجة القشرية الإقليمية والأعصاب المحيطة. كما تتيح الحقن داخل القراب زيادة بم

intrathecal-injection-newborn-mouse-for-genome-editing-drug

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

المصدر: Zamboni، M.، et al.، تحريض تعديل الخلايا البريمية السحائية عن طريق الحقن داخل الخزان. J. Vis. Exp. (2020)يوضح هذا الفيديو إجراء توصيل دواء محفز إلى صهريج فأر مخدر. يحفز الحقن بشكل انتقائي التعبير عن علامات الفلورسنت في خلايا سطح الدماغ التي يمكن الوصول إليها عن طريق السائل النخاعي ، والتي يؤكدها التصوير الفلوري.

توصيل الدواء المستهدف في نموذج الفأر عبر حقن Cisterna Magna

يصف هذا الفيديو تقنية فعالة للحث على الأورام الأرومية الدبقية (GBM) باستخدام الحمض النووي المنقولات المحقون في بطينات الفئران حديثي الولادة. خلايا المنطقة تحت البطينية ، التي تمتص البلازميد ، تتحول وتتكاثر وتولد أورام ذات خصائص نسيجية مرضية ل GBM البشري.

تحريض الورم الأرومي الدبقي باستخدام التبديل بوساطة SB: تقنية لتوليد نموذج فأر جديد باستخدام التكامل بوساطة الينقولات لبلازميد SB في دماغ الفأر حديثي الولادة

المصدر: Fricano-Kugler, C. J., et al. تصميم وتعبئة وتسليم فيروسات CRISPR الرجعية عالية الارتفاع والعدسات عبر الحقن التجسيمي. J. Vis. Exp. (2016)يوضح هذا الفيديو الحقن الفيروسي التجسيمي لتحرير الجينات العصبية بدقة في دماغ الفأر. يضمن البروتوكول توصيل الفيروس بدقة إلى التلفيف المسنن ، مما يتيح وضع العلامات الفلورية والضربة القاضية الجينية بوساطة كريسبر لدراسة الدوائر العصبية ووظيفة الجينات وآليات المرض في الجسم الحي.

الحقن الفيروسي التجسيمي لتحرير الجينات العصبية المستهدفة في دماغ الفأر

المصدر: Li, D., et al. الحقن المباشر داخل القراب للفيروسات المؤتلفة المرتبطة بالغة في الفئران البالغة. J. Vis. Exp. (2019)يوضح هذا الفيديو إجراء الحقن داخل القراب للفيروسات المرتبطة بالغدة (AAV) في السائل النخاعي (CSF) للفأر المستيقظ ، ويغطي تحضير المحقنة ، ومحاذاة العمود الفقري ، وإدخال الإبرة بدقة. تتحقق هذه الطريقة من صحة توصيل الجينات المستهدفة ، مما يدعم إمكاناتها لعلاجات الجهاز العصبي المركزي.

توصيل الفيروسات داخل القراب في نموذج الفأر لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي

ويصف هذا التقرير تقنية بسيطة وسريعة من داخل القراب ثقب إبرة لترنسفكأيشن المترجمة من سيرنا في النخاع الشوكي القطني في الماوس تحت التخدير قصيرة ضوء دائم.

في فيفو سيرنا ترنسفكأيشن والجينات ضربة قاضية في الحبل الشوكي عن طريق السريع موسع قطني داخل القراب الحقن في الفئران

نوضح هنا تقنية لنقل الخلايا العصبية على نطاق واسع عن طريق الحقن داخل البطين للفيروس المرتبط بالغدة في دماغ الفأر حديثي الولادة.  توفر هذه الطريقة طريقة سريعة وسهلة لتحقيق التعبير مدى الحياة عن الجينات المعدلة وراثيا التي يتم تسليمها عن طريق الفيروس.

حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية

نماذج حيوانية من المرض لدى الأطفال يمكن أن تواجه بداية مبكرة وتطور المرض العدواني. سريريا تقديم العلاج ذات الصلة لنماذج الماوس الشباب يمكن أن يكون صعبا من الناحية الفنية. يصف هذا البروتوكول طريقة الحقن في الوريد غير الغازية عن الفئران حديثي الولادة في غضون شهرين بعد الولادة الأيام الأولى من الحياة.

الحقن في الوريد في الفئران حديثي الولادة

يصف لنا على بروتوكول لجراحة ستيريوتاكسيك مع جهاز ثابت رئيس محلية صنع الكاشفات ميكروينجيكتينج في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. هذا الأسلوب يتيح التلاعب بالجينات في الخلايا العصبية في مناطق معينة من أدمغة الفأر حديثي الولادة.

جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال

في هذا البروتوكول ، نصف كيفية حقن التجويف الأمنيوسي للفأر عند E7.5 مع lentivirus ، مما يؤدي إلى نقل موحد للصفيحة العصبية بأكملها ، مع الحد الأدنى من الآثار الضارة على البقاء على قيد الحياة أو التطور الجنيني.

استهداف الصفائح العصبية الفئرانية بواسطة حقن النانو في الرحم (NEPTUNE) في اليوم الجنيني 7.5

يوصف إجراء جراحي لإجراء الحقن في الخزان القطني للفئران الأحداث. وقد استخدم هذا النهج لتوصيل نواقل العلاج الجيني داخل القراب ، ولكن من المتوقع أن يمكن استخدام هذا النهج لمجموعة متنوعة من العلاجات ، بما في ذلك الخلايا والعقاقير.

توصيل النواقل داخل القراب في الفئران اليافعة عن طريق حقن الصهريج القطني

يمثل الحقن داخل القراب القطني طريقا مناسبا للإعطاء لتوصيل العلاج الجيني إلى الجهاز العصبي المركزي. يهدف هذا البروتوكول الموحد الشامل للحقن داخل القراب القطني في الفئران والجرذان حديثي الولادة والأحداث والبالغين إلى توجيه الباحثين في اعتماد هذه التقنية لدراسات العلاج الجيني قبل السريري.

الحقن داخل القراب القطني لنواقل العلاج الجيني لاستهداف الجهاز العصبي المركزي في الفئران والجرذان

تعلم تقنية الحقن داخل القراب للفأر حديث الولادة لتحرير الجينوم وتوصيل الدواء مباشرة إلى الجهاز العصبي المركزي. هذه الطريقة تُحسّن سلامة العلاجات وتزيد من كفاءة التحرير الجيني في نماذج الاضطرابات العصبية التنموية.

الحقن داخل القراب للفأر حديث الولادة لتحرير الجينوم وتوصيل الدواء

استكشف المزيد من الفيديوهات