تطوير مقايسات RT-qPCR متعددة الإرسال في الوقت الحقيقي للكشف عن SARS-CoV-2 وأنفلونزا A / B و MERS-CoV
نوفمبر 10, 2023
نقدم مجموعتين داخليتين من RT-qPCR بخطوة واحدة قائمة على المسبار لفيروسات الجهاز التنفسي الشائعة. الفحص الأول هو ل SARS-CoV-2 (N) ، والإنفلونزا A (H1N1 و H3N2) ، والإنفلونزا B. والثاني هو ل SARS-Cov-2 (N) و MERS (UpE و ORF1a). يمكن تنفيذ هذه المقايسات بنجاح في أي مختبر متخصص.
الهدف العام من هذا الاختبار هو إدارة نهج متعدد الإرسال للكشف المتزامن عن فيروسات الجهاز التنفسي المنتشرة بشكل شائع مثل SARS-CoV-2 و MERS و الإنفلونزا A و Influenza B ، وتشمل التقنيات السائدة التي تقود التقدم في مجالنا CRISPR ، ومقايسات التدفق الأميني الجانبي ، وأجهزة الاستشعار الجزيئية الحيوية الورقية ، واختبار شيرلوك في وعاء واحد ، وأبستامير الحمض النووي ، و RT-qPCR متعدد الإرسال المتكامل مع التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة ، مصباح. ومع ذلك ، فإن RT-qPCR متعدد الإرسال هو الأكثر حساسية وشيوعا وهو المعيار الذهبي لتشخيص الفيروسات المختلفة. يتمثل التحدي التجريبي الحالي في إنشاء بروتوكول يمكن استخدامه للكشف عن نسخ الحمض النووي الريبي التي تصل إلى 10 نسخ.
استخدمنا مجموعة RT-qPCR الداخلية للفحص ، وهي فعالة من حيث الوقت والتكلفة. للبدء ، قم بإعداد المخزن المؤقت 2x ل RT-qPCR في المياه الخالية من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي قم بتخزين المخزن المؤقت عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام الآخر. بعد ذلك ، امزج الاشعال والمجسات في أنبوب سعة 1.5 مل.
قم بتكوين الحجم باستخدام محلول الشطف ، ثم قم بتخزين الأنبوب عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإعداد مزيج إنزيم مع بوليميراز taq و MMLV-RT في أنبوب سعة 1.5 مل على الثلج. قم بتكوين الحجم باستخدام مخزن تخزين بوليميراز taq.
الآن قم بإعادة تعليق الحمض النووي الريبي الاصطناعي الفيروسي في أنابيب منفصلة مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA لعمل مخزون من 10 إلى سادس نسخ من الحمض النووي الريبي لكل ميكرولتر. لخلط مخزونات الفيروس ، أضف خمسة ميكرولترات لكل من SARS-CoV-2 والإنفلونزا A و B إلى 50 ميكرولترا من محلول Tris-EDTA. وبالمثل ، امزج SARS-CoV-2 و MERS-CoV للحصول على مزيج فيروسي ثان.
قم بتخفيف كلا الخليطين عشرة أضعاف للحصول على تخفيف نهائي بمقدار 10 نسخ من الحمض النووي الريبي لكل ميكرولتر. لكل بئر من صفيحة 96 بئر ، ماصة 2x عازلة ، برايمر ، إنزيم ، ماء خال من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، ومخاليط الحمض النووي الريبي المقابلة. أغلق اللوحة بختم لوحة لاصقة.
ثم قم بالطرد المركزي للوحة لمدة دقيقة واحدة لتجميع السائل في قاع البئر. بعد ذلك ، قم ببرمجة جهاز PCR لقبول نوع كتلة البئر 96 السريع مع ضبط النوع التجريبي على المنحنى القياسي. قم بتعيين الكواشف إلى كواشف TaqMan وحدد خصائص التشغيل القياسية.
تحديد أهداف الجينات وصبغة المراسل. ثم حدد أسماء العينات لكل تفاعل ليتم اختباره وتعيين الأهداف والعينات لتخطيط اللوحة. الآن أدخل برنامج الدورة في الأداة.
انقل اللوحة إلى جهاز QPCR في الوقت الفعلي في الاتجاه الصحيح واضغط على تشغيل لبدء الدورة. اختر موقع الملف لحفظ البيانات التجريبية. ثم فحص مخططات التضخيم التي يوفرها برنامج QPCR.
تمكنت المجموعتان المطورتان من تضخيم جميع الجينات المستهدفة الثلاثة بنجاح في وقت واحد ، مع انخفاض يصل إلى 10 نسخ من الحمض النووي الريبي لكل تفاعل. كانت كفاءات التضخيم لجميع أجهزة المعايرة بالتحليل الحجمي الفيروسية أعلى من 99٪
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تطوير مجموعتين من أدوات RT-qPCR ذات الخطوة الواحدة والقائمة على المجسات، والمصممة للكشف المتزامن عن الفيروسات التنفسية الشائعة، بما في ذلك SARS-CoV-2 وMERS وسلالات مختلفة من الإنفلونزا. وتعزز هذه الأدوات القدرات التشخيصية للمختبرات المتخصصة من خلال نهج فعال من حيث التكلفة والوقت.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- الكشف عن الفيروسات التنفسية
- تقنية RT-qPCR
- تطوير مقايسة متعددة
خلفية علمية
- الضرورة الملحّة للتشخيص السريع والحساس للفيروسات التنفسية.
- محدودية تقنيات الكشف الحالية.
- أهمية اتباع نهج متعدد الإرسال للكشف المتزامن.
الطرق المستخدمة
- أطقم RT-qPCR المطورة داخلياً
- الكشف عن RNA الفيروسي
- تقنية RT-qPCR المتعددة المدمجة مع مسابير محددة
النتائج الرئيسية
- الكشف بنجاح عن SARS-CoV-2 وMERS إلى جانب الإنفلونزا A وB.
- تحقيق تضخيم عند تركيزات من نسخ RNA تصل إلى 10 نسخ لكل تفاعل.
- إثبات كفاءات تضخيم عالية تتجاوز 99% للجينات المستهدفة.
الاستنتاجات
- تعد مجموعات RT-qPCR المطورة فعالة للكشف المتعدد عن الفيروسات التنفسية.
- تساهم هذه الدراسة في تحسين استراتيجيات التشخيص في أبحاث علم الفيروسات.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تلبي فحوصات RT-qPCR في الوقت الحقيقي متعددة الإرسالات لـ SARS-CoV-2، والإنفلونزا A/B، وMERS-CoV الحاجة الماسة للكشف السريع والحساس والمحدد عن الفيروسات التنفسية المنتشرة معاً في الأبحاث الاستكشافية والترجمية. وتتيح هذه الفحوصات تمييزاً عالي الموثوقية للأهداف الفيروسية، مما يدعم التحقق القوي من الأهداف ويقلل من الغموض في المراحل المبكرة من تطوير التشخيص. ويعزز دمجها من الثقة التنبؤية والكفاءة التشغيلية عبر محافظ البحث والتطوير التي تركز على تهديدات الأمراض المعدية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء الدقيق للأهداف الفيروسية من أجل التحقق الوظيفي في نماذج الأمراض التنفسية.
- يدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال التمييز بين الممرضات الفيروسية ذات الصلة الوثيقة في العينات المعقدة.
- يسهل تعزيز الثقة التنبؤية في اختيار الأهداف وفرزها لصالح البرامج التشخيصية والعلاجية.
الفحص وتطوير المقايسة
- يُجهز أنظمة مقايسة متعددة الإرسال ومصدقة للفحص اللاحق للمركبات المضادة للفيروسات أو للتشخيص.
- يُقدم مخرجات كمية ومعيارية وقابلة للتكرار لغرض مقارنة المقايسة وتحسينها.
- يُتيح الجاهزية للفحص عالي الإنتاجية والقابل للتوسع من أجل التقييم السريع للتدخلات المرشحة.
الأبحاث التحويلية وما قبل السريرية
- يتماشى مع استراتيجيات المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال تمكين الكشف المتزامن عن فيروسات تنفسية متعددة.
- يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق ما قبل السريري عبر توفير كشف فيروسي كمي وقوي.
- يقلل من المخاطر عند تطوير المرشحات العلاجية من خلال ضمان التحديد الدقيق لمسببات الأمراض في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
تكامل تدفق العمل والمسار التحليلي
تندرج فحوصات RT-qPCR المتعددة (Multiplex) ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، حيث تدعم الاختبارات المبكرة للفرضيات، وتطوير الفحوصات، والأبحاث الانتقالية الخاصة بمجموعات الأمراض المعدية.
- بيولوجيا الاكتشاف: توفر كشفاً عالي الحساسية للتحقق من صحة الأهداف الفيروسية بناءً على الفرضيات.
- الفحص: تقدم نتائج كمية قابلة للتكرار لتوحيد المقايسات وتقييم المركبات.
- التحليلات: توفر بيانات تضخيم قوية ومقاييس نوعية للتحليل المقارن.
- الأبحاث الترجمية: تتيح مواءمة المؤشرات الحيوية والاستمرارية عبر مراحل البحث.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة للتكيف وإعادة الاستخدام للكشف الفيروسي المتعدد في مختلف إعدادات البحث والتطوير.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتحد من الغموض الميكانيكي في الكشف عن الفيروسات.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع في سير عمل التشخيص.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن اتخاذ القرارات بالاستمرار أو التوقف وكفاءة رأس المال من خلال تمكين التمييز المبكر والدقيق بين المسببات المرضية.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض ببرامج الأمراض المعدية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم الفيروسات الجزيئي وتصميم مقايسة PCR الكمية.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة PCR في الوقت الحقيقي وبنية تحتية لبرمجيات التحليل.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق لإعداد المقايسة، وتفسير البيانات، ومراقبة الجودة.
- قد يتطلب التكييف لأنواع مختلفة من العينات أو المتغيرات الفيروسية الناشئة.
- يعتمد الأداء على خصوصية البادئ/المسبار وجودة RNA كما هو مدعوم في المصدر.
