Name: دراسة بدء موت الخلايا باستخدام المجهر الرقمي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: اكتشف طريقة التصوير المستمر لدراسة بدء موت الخلايا في نباتات البطاطس باستخدام المجهر الرقمي. يتيح هذا البروتوكول مراقبة دقيقة لتكوّن الآفات وتوسعها على مدى 8.5 ساعة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونشكر باربرا ياكليتش على المساعدة التقنية. وقدمت الوكالة السلوفينية للبحوث والابتكار الدعم المالي لهذا البحث (التمويل الأساسي للبحوث رقم P4-0165 والمشروع Z4-3217: فك رموز الترابط بين الإشارات المتصلة بالاختزال في مقاومة البطاطا للفيروسات).

ملاحظة: يصف القسمان 1 و2 بروتوكولا معدلا لإعداد المواد النباتية استنادا إلى الأساليب التي حددها Lukan et al.7. على وجه التحديد ، تم إجراء بعض التعديلات على الظروف البيئية الخاضعة للرقابة وإعداد اللقاح.
1. زراعة نباتات البطاطس
<ol><li>تنمو السيرة الذاتية البطاطا صحية. نباتات ريوال في زراعة أنسجة العقدة الجذعية8.</li>
	<li>بعد 6-8 أسابيع ، قم بقطع عشرة نباتات بطول 1 سم تحتوي على عقد من نباتات البطاطس على ورق معقم في ظروف معقمة باستخدام ملاقط معقمة وسكين مشرط.</li>
	<li>قم بنقلها إلى صناديق بلاستيكية بوسط Murashige و Skoog (MS30) (الشكل 1 أ) وقم بزراعتها في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة (22 درجة مئوية في الضوء و 19 درجة مئوية في الظلام مع إشعاع 250 μE أو μmol / m2 / s وفترة ضوئية 16 ساعة ، عند رطوبة نسبية تبلغ 55٪ ± 5٪).</li>
	<li>نقلها إلى التربة 2 أسابيع بعد التكاثر الدقيق.<ol><li>املأ الأواني (r = 10 سم) بالتربة. استخدم إصبعا لإنشاء ثقب بعمق 3-4 سم في التربة في منتصف الإناء ، واملأ الحفرة بالماء ، وانتظر حتى تمتص.</li>
		<li>ضع نباتا واحدا لكل وعاء في الحفرة ، واترك الأوراق فوق السطح. قم بتغطية الجذور برفق بالتربة (الشكل 1 ب). ملاحظة: قد لا تتطور جذور بعض النباتات. استبعاد تلك النباتات من التحليل.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بزراعة النباتات في التربة في غرفة نمو في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة (22 درجة مئوية في الضوء و 19 درجة مئوية في الظلام ، عند رطوبة نسبية تبلغ 55٪ ± 5٪ ، مع إشعاع 250 ميكرومول / م2 / ثانية وفترة ضوئية 16 ساعة).</li>
	<li>بعد 3-4 أسابيع ، النباتات جاهزة. استخدم هذه النباتات ليتم تلقيحها. ملاحظة: يجب أن تحتوي النباتات على 3-4 أوراق مكتملة النمو على الأقل مع منشورات مرئية (الشكل 1 ج). يجب أن تبدو صحية ، مع عدم وجود أعراض واضحة (أوراق صفراء أو بنية) ، والتي يمكن أن تكون مخطئة للآفات التي تسببها PVY. لتحقيق نتائج قابلة للمقارنة ، يجب تلقيح النباتات في نفس الوقت (على سبيل المثال ، في الساعة 9 صباحا) في جميع التجارب لتجنب الآثار المحتملة لإيقاع الساعة البيولوجية على الاستجابة المناعية للنبات وتكوين الآفات9،10،11.</li>
</ol>2. إعداد اللقاح وتلقيح البطاطس
<ol><li>تلقيح النبات بسلالة PVY N-Wilga (PVYN-Wi ؛ رقم الانضمام. EF558545) اللقاح كما هو مذكور أدناه. ملاحظة: يمكن تلقيح المزيد من النباتات بالتوازي في حالة توفر أكثر من مجهر رقمي واحد. يجب أن تحتوي النباتات على ثلاث أوراق مكتملة النمو على الأقل قبل التلقيح (الشكل 1 ج). يتم ضرب PVYN-Wi والحفاظ عليها في السيرة الذاتية للبطاطس. بنتلاند.<ol><li>تحضير العازلة للفوسفات ، مع استكمال ثنائي إيثيل ديثيوكربامات الصوديوم (DIECA) ، للتلقيح: مزيج 1.3 مل من 0.2 M NaH 2 PO 4 ، 8.7 مل من 0.2 M Na2HPO4 ، و 0.225 جم من DIECA. اجعل الحجم إلى 100 مل باستخدام ddH20. اضبط الأس الهيدروجيني على 7.6 بإضافة 1 M NaOH أو 1 M HCl محلول.</li>
		<li>حصاد 6-8 أسابيع من العمر PVYN-Wi السيرة الذاتية للبطاطس المصابة. نباتات بنتلاند من زراعة الأنسجة في أكياس استخراج مع شبكة مرشح (0.5 جم لكل 6 نباتات) وإضافة محلول فوسفات مكمل ب DIECA (كتلة 4x من المواد النباتية ، الكتلة: نسبة الحجم). استخدم الخالط اليدوي لمدة 1-2 دقيقة للحصول على محلول متجانس.</li>
		<li>قم بغبار الأوراق الثلاثة الأولى المطورة بالكامل من نباتات البطاطس التي يبلغ عمرها 3-4 أسابيع (من الخطوة 1.6) بمسحوق الكربوروندوم. ملاحظة: اضبط كمية مسحوق الكاربوروندوم. الكثير قد يسبب الضرر ، في حين أن القليل جدا قد يؤدي إلى عدوى غير فعالة. على النحو الأمثل ، يتم استخدام 0.1 مجم / سم من مسحوق الكربوروندوم ، وهو ما يقرب من 1.5 مجم من المسحوق لكل ورقة متوسطة الحجم (حوالي 15 سم2).</li>
		<li>فرك الأوراق بلطف مع اللقاح (~ 100 ميكرولتر لكل ورقة). بعد 10 دقائق ، اغسل الأوراق جيدا بماء الصنبور.<ol><li>احرص على عدم الإضرار بالأوراق. لا تتجاوز وقت الحضانة. اضبط كمية اللقاح وفقا لحجم الورقة - 6.5 ميكرولتر / سم ، أي ما يقرب من 100 ميكرولتر لكل ورقة متوسطة الحجم (حوالي 15 سم2).</li>
		</ol></li>
		<li>نقل النباتات إلى غرفة النمو وزراعتها في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة (28 درجة مئوية في الضوء و 28 درجة مئوية في الظلام عند رطوبة نسبية تبلغ 55٪ ± 5٪ ، مع إشعاع 250 ميكرومول / م2 / ثانية وفترة ضوئية 16 ساعة) لمدة 3 أيام.</li>
	</ol></li>
</ol>3. تحضير النبات واستخدام المجهر الرقمي لتسجيل تطور الآفة
<ol><li>نقل النباتات الملقحة من غرفة النمو التي يتم الحفاظ عليها عند 28 درجة مئوية إلى غرفة النمو عند 22 درجة مئوية بعد 3 أيام من التلقيح ، مع شروط أخرى كما هو موضح في الخطوة 1.5.</li>
	<li>حدد مصنعا للمراقبة. شل حركة الورقة الملقحة الثانية باستخدام شريط (الشكل 1 د). تأكد من تثبيت الورقة المرغوبة تماما قبل البدء في التصوير (الشكل 1 د).</li>
	<li>قم بتثبيت تطبيق برمجي لالتقاط الصور على الكمبيوتر المحمول. قم بتوصيل المجهر الرقمي بالكمبيوتر. افتح البرنامج. ملاحظة: تأكد من وضع المصنع والمجهر الرقمي والكمبيوتر المحمول على الرف بالقرب من المقبس لتوصيل الكمبيوتر. قد يعتمد القرار بشأن اختيار الأوراق المراد رصدها على المسألة البيولوجية المدروسة ، على سبيل المثال ، نوع العملية التي تؤدي إلى تكوين موت محدود للخلايا المبرمجة.</li>
	<li>اضبط المجهر فوق الورقة الثابتة. ركز باستخدام القرص على المجهر الرقمي (كما هو موضح في الشكل 1E).<ol><li>تأكد من أن خط الرؤية واسع قدر الإمكان لزيادة فرص التقاط تكوين الآفة ولكن لا يزال مكبرا بدرجة كافية لتحديد مظهر الآفة (عادة ، يتم استخدام تكبير 25x).</li>
	</ol></li>
	<li>اضبط إعدادات الكاميرا. انقر فوق الزر "إعدادات" في الزاوية اليمنى العليا من الصورة (الشكل 2 أ ، الجزء المحاط بدائرة 1) واضبط إعدادات الكاميرا: السطوع (60-70) ، التباين (10-15) ، تدرج اللون (0) ، توازن اللون الأبيض ، التشبع (45-50) ، الحدة (0) ، جاما (5) ( الشكل 2 ب). كانت الإعدادات المستخدمة في هذه الدراسة على النحو التالي: السطوع (64) ، التباين (14) ، الصبغة (0) ، التشبع (47) ، الحدة (0) ، جاما (5). ملاحظة: يجب ضبط إعدادات الكاميرا على الإضاءة الخارجية لضمان أفضل جودة للصورة. يمكن تكييف الإعدادات وفقا لظروف المستخدم في غرفة النمو.</li>
	<li>اضبط إعدادات التقاط الصور بالنقر فوق رمز التقاط الصور (الشكل 2C ، الجزء المحاط بدائرة 2). انقر فوق الزر فيديو منقضي وقتي واضبط التقاط الصور كل 15 دقيقة لمدة 24 ساعة (الشكل 2 ج). ملاحظة: الفاصل الزمني بين الصور الملتقطة ومدة التصوير مرن تماما ويمكن تكييفه وفقا لاحتياجات التجربة. في الوقت بين التقاط الصورة ، يتم إيقاف تشغيل ضوء LED. يتم تشغيل ضوء LED تلقائيا أثناء التقاط الصورة.</li>
	<li>ابدأ التقاط الصور بالنقر فوق الزر START (الشكل 2C). ملاحظة: بعد نقلها من 28 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية ، يجب أن تبدأ النباتات في تطوير الآفات في غضون 24 ساعة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد يكون هذا علامة على التلقيح غير الفعال. اضبط كمية مسحوق الكربوروندوم ، وتأكد من أن وقت حضانة اللقاح على الأوراق كان صحيحا ، وحدد وفرة الفيروس في اللقاح بواسطة qPCR.</li>
	<li>لحفظ الصور ، حدد جميع الصور وانقر فوق حفظ رمز (الشكل 2 ب ، الجزء المحاط بدائرة 3). تعيين خيارات التصدير. اضبط DPI بحد أقصى (300) (الشكل 2D). بعد الحفظ ، احذف جميع الصور في البرنامج.</li>
	<li>لتحليل الصور ، يكفي أي برنامج لعرض / تحرير الصور. استخدام البرمجيات الحرة لتحرير الصور، ImageJ، موضح أدناه.<ol><li>استيراد التسلسل الزمني للصور من مجال رؤية واحد (في الزاوية العلوية اليمنى، انقر فوق ملف، وحدد استيراد، ثم تسلسل الصور). الصق مسار دليل الصور المحفوظة واضغط على الزر موافق ( OK ) لبدء التحويل.</li>
		<li>بعد التحويل ، يفتح البرنامج تلقائيا مشغل فيديو داخلي يعرض الفيديو النهائي. قم بتصدير ملف الفيديو بالنقر فوق ملف > حفظ باسم الخيار وتحديد تنسيق AVI. تفتح نافذة صغيرة. اضبط معدل الإطارات على 0.3 إطارا في الثانية واضغط على OK لحفظ الفيديو كملف فيديو AVI. ملاحظة: يمكن أيضا تحديد وقت تطور الآفة عن طريق التحقق يدويا من جميع الصور والعثور على صورة تظهر فيها الآفة.</li>
	</ol></li>
</ol>

القياس الكمي لبدء موت الخلايا من خلال التصوير المستمر

<ol><li>Karasev, A. V., Gray, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+emerging+challenges+of+potato+virus+y+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Continuous and emerging challenges of potato virus y in potato.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 571-586 (2013).</li>
<li>Quenouille, J., Vassilakos, N., Moury, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+Y%3A+A+major+crop+pathogen+that+has+provided+major+insights+into+the+evolution+of+viral+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Potato virus Y: A major crop pathogen that has provided major insights into the evolution of viral pathogenicity.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (5), 439-452 (2013).</li>
<li>Szajko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+gene+Ny-1+on+potato+chromosome+IX+confers+hypersensitive+resistance+to+Potato+virus+Y+and+is+an+alternative+to+Ry+genes+in+potato+breeding+for+PVY+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">The novel gene Ny-1 on potato chromosome IX confers hypersensitive resistance to Potato virus Y and is an alternative to Ry genes in potato breeding for PVY resistance.</a> Theoretical and Applied Genetics. 116 (2), 297-303 (2008).</li>
<li>Szajko, K., Strzelczyk-Żyta, D., Marczewski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ny-1+and+Ny-2+genes+conferring+hypersensitive+response+to+potato+virus+Y+%28PVY%29+in+cultivated+potatoes%3A+Mapping+and+marker-assisted+selection+validation+for+PVY+resistance+in+potato+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Ny-1 and Ny-2 genes conferring hypersensitive response to potato virus Y (PVY) in cultivated potatoes: Mapping and marker-assisted selection validation for PVY resistance in potato breeding.</a> Molecular Breeding. 34 (1), 267-271 (2014).</li>
<li>Lukan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+is+not+sufficient+for+the+restriction+of+potato+virus+Y+spread+in+hypersensitive+response-conferred+resistance+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Cell death is not sufficient for the restriction of potato virus Y spread in hypersensitive response-conferred resistance in potato.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 168(2018).</li>
<li>Baebler, Š, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+is+an+indispensable+component+of+the+Ny-1+resistance-gene-mediated+response+against+Potato+virus+y+infection+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid is an indispensable component of the Ny-1 resistance-gene-mediated response against Potato virus y infection in potato.</a> Journal of Experimental Botany. 65 (4), 1095-1109 (2014).</li>
<li>Lukan, T., Coll, A., Baebler, Š, Gruden, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virus+spread+around+the+cell+death+zone+at+spatiotemporal+resolution+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virus spread around the cell death zone at spatiotemporal resolution using confocal microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 2447, 261-270 (2022).</li>
<li>Vinterhalter, D., Dragiüeviü, I., Vinterhalter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+in+vitro+culture+techniques+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Fruit%2C+Vegetable+and+Cereal+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potato in vitro culture techniques and biotechnology.</a> Fruit, Vegetable and Cereal Science and Biotechnology. 2, Special Issue 16-45 (2008).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator).</a> Nature. 470, 110-115 (2011).</li>
<li>Roden, L. C., Ingle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lights%2C+rhythms%2C+infection%3A+The+role+of+light+and+the+circadian+clock+in+determining+the+outcome+of+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lights, rhythms, infection: The role of light and the circadian clock in determining the outcome of plant-pathogen interactions.</a> Plant Cell. 21 (9), 2546-2552 (2009).</li>
<li>Srivastava, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+circadian+rhythm+in+plant+system%3A+An+update+from+development+to+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Role of circadian rhythm in plant system: An update from development to stress response.</a> Environmental and Experimental Botany. 162, 256-271 (2019).</li>
<li>Mulaosmanovic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+detection+and+quantification+of+lesions+on+leaf+scale+based+on+trypan+blue+staining+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for detection and quantification of lesions on leaf scale based on trypan blue staining and digital image analysis.</a> Plant Methods. 16, 62(2020).</li>
<li>Martinelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+plant+disease+detection.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+Sustainable+Development%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of plant disease detection. A review.</a> Agronomy for Sustainable Development. 35, 1-25 (2015).</li>
<li>Ali, M., Bachik, N., Muhadi, N. A., Tuan Yusof, T. N., Gomes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+techniques+of+detecting+plant+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Non-destructive techniques of detecting plant diseases: A review.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 108, 101426(2019).</li>
<li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+and+Electronics+in+Agriculture%22%5BJournal%5D)">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Computers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>Rowarth, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+reveals+potential+regulators+of+programmed+cell+death+and+leaf+remodelling+in+lace+plant+%28Aponogeton+madagascariensis%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis reveals potential regulators of programmed cell death and leaf remodelling in lace plant (Aponogeton madagascariensis).</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 375(2021).</li>
</ol>

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

يسمح البروتوكول الموضح للمستخدم بتحديد معدل بدء موت الخلية بدقة عن طريق التصوير المستمر للأوراق الملقحة في الوقت بين بدء موت الخلية وظهور موت الخلية باستخدام مجهر رقمي. على الرغم من وجود طرق عديدة لمراقبة حدوث الآفات والأمراض النباتية12،13،14،15 ، فإن هذا البروتوكول يقدم ميزة القياس المستقل عن الضوء دون الإخلال بإيقاع الساعة البيولوجية للنبات ، حيث يتم إيقاف تشغيل الضوء بين القياسات.
بعد التلقيح ، يجب أن تنمو النباتات عند 28 درجة مئوية لمدة 3 أيام. يعتمد جين مقاومة Ny-1 ، الذي يحفز استجابة شديدة الحساسية ، على درجة الحرارة ، وفي النباتات التي تزرع في درجات حرارة أعلى ، يؤدي إلى إجهاض المقاومة ، والذي يتجلى في نقص تكوين الآفة وانتشار الفيروس الجهازي3. بعد نقل النباتات إلى 22 درجة مئوية ، يبدأ موت الخلايا ، لذلك للحصول على نتائج دقيقة ، يجب أن تبدأ المراقبة باستخدام المجهر الرقمي في أقرب وقت ممكن بعد هذا النقل. خطوة أخرى حاسمة في إعداد النبات للتصوير هي تثبيت الورقة (الشكل 1D) ، حيث سيستمر النبات في النمو أثناء التصوير ، مما قد يؤدي إلى إبعاد الورقة المرصودة عن التركيز ، أو أن هذا الإعداد لن يعطي النتائج المرجوة.
إذا تم استخدام البروتوكول الموصوف على النباتات المحورة وراثيا ذات المكونات المتغيرة ذات الأهمية ، والتي يفترض أنها تشارك في بدء موت الخلايا ، فإن البروتوكول يمكن المستخدم من تحديد ما إذا كان المستوى المنخفض للمكون المدروس يؤثر على معدل بدء موت الخلية. من خلال ذلك ، يمكن تحديد المكونات المشاركة في بدء موت الخلايا في الأنظمة المرضية ، حيث يحدث موت الخلايا المبرمج ، باستخدام هذا البروتوكول. الطرق الأخرى لتحديد هذه المكونات هي ، على سبيل المثال ، التحليل النسخي مثل RNA-seq أو أشكال مختلفة من الفحص المجهري ، والتي يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاطويلا 16. تسمح الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول بتحديد سهل وغير مكلف للمكونات المشاركة في بدء موت الخلايا من خلال ملاحظة الاختلافات في معدلات بدء موت الخلايا بين النباتات المحورة وراثيا ومحطات التحكم. على النحو الأمثل ، في مثل هذا الإعداد ، يجب استخدام كاميرتين رقميتين ، حيث يجب تحليل النبات المعدل وراثيا بالتوازي مع مصنع التحكم في نفس التجربة.
في هذا البروتوكول ، تم استخدام سلالة PVY N-Wilga. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام سلالات أخرى من هذا الفيروس ، على سبيل المثال ، PVY (PVY-N605 (123) -GFP) 7 الموسومة ب GFP. علاوة على ذلك ، يمكن دراسة الأنظمة المرضية الأخرى ، والتي تؤدي إلى تطور موت الخلايا المبرمج باستخدام هذا البروتوكول مع تعديل طفيف.

البطاطا هي واحدة من المحاصيل الغذائية الأكثر زراعة على نطاق واسع في العالم، وتحتل المرتبة الرابعة بعد الأرز والقمح والذرة. ومع ذلك، يمكن أن يتأثر إنتاج البطاطا بشدة بفيروس البطاطا Y (PVY)، الذي يعتبر حاليا أهم مسببات الأمراض الفيروسية 1,2. في نباتات البطاطس السيرة الذاتية. Rywal ، عدة سلالات من PVY (بما في ذلك سلالة PVY N-Wilga) تؤدي إلى استجابة شديدة الحساسية (HR) - مقاومة ، حيث يظهر تقييد العامل الممرض لموقع العدوى على شكل آفات نخرية على الأوراق الملقحة3. في هذا النظام المرضي ، يتم التوسط في HR بواسطة جين مقاومة Ny-1 ، والذي يعتمد على درجة الحرارة ، حيث أن النباتات التي تنمو في درجات حرارة منخفضة تتطور بكفاءة إلى آفات نخرية ، بينما في النباتات التي تنمو بشكل أساسي عند درجة حرارة مرتفعة (28 درجة مئوية) ، يظهر إجهاض المقاومة على أنه نقص في تكوين الآفة وانتشار الفيروس الجهازي 3,4. عندما يتم نقل النباتات إلى درجة حرارة منخفضة (22 درجة مئوية) ، يبدأ موت الخلايا ، والذي يمكن استغلاله لمتابعة معدل بدء موت الخلية عن طريق تصوير الأوراق الملقحة في الوقت بين بدء موت الخلية وظهور موت الخلية.
يوضح هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتحديد معدل بدء موت الخلايا باستخدام المجهر الرقمي. من خلال تصوير الأوراق الملقحة بعد نقل النبات من 28 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية ، يتيح المجهر الرقمي المراقبة المستمرة للورقة في الفترات المرغوبة. على عكس استخدام الطرق الأخرى (على سبيل المثال ، الفحص المجهري متحد البؤر أو مراقبة تكوين الآفة بالعين المجردة) ، فإن هذا يسمح بتحديد الوقت الدقيق لتشكيل الآفة وبالتالي معدل بدء موت الخلية حتى دقائق بالضبط ، بدلا من ساعات في الطرق المذكورة أعلاه 5,6. استخدام المجهر الرقمي مستقل أيضا عن الضوء وبالتالي يمكن استخدامه أثناء النهار والليل. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتحديد المكونات المشاركة في بدء موت الخلايا أو لتحديد تأثيرات المكونات المختلفة على معدل بدء موت الخلايا إذا كانت النباتات المستخدمة محورة وراثيا ولديها مستويات متغيرة من المكونات ذات الأهمية.

<table><tbody><tr><td>موقد الكحول</td><td>Mikro + Polo</td><td>SH-234002455</td><td>للملاقط والتعقيم المشرط</td></tr><tr><td>الأوتوكلاف A-21 CAV</td><td>Kambi<img alt="المعادلة 1" src="/%20%D8%A7%D9%84%D9%85%D9%84%D9%81%D8%A7%D8%AA%20/%20ftp_upload/65824%20/%2065824eq01.jpg"></td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton و Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Carborundum powder</td><td>VWR Chemicals</td><td>22505297</td><td></td></tr><tr><td>DinoCapture 2.0 &amp; nbsp ؛</td>برنامج <td>Dino-Lite</td><td>الإصدار 2.0</td><td>للمجهر الرقمي</td></tr><tr><td>Dino-Lite Edge AM7915MZTL المجهر الرقمي</td><td>AnMo Electronics Corporation</td><td>AM7915MZTL</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول ، 70٪</td> <td>Stella Tech</td><td>P94000</td><td>للملاقط والتعقيم</td></tr><tr><td>المشرط أكياس الاستخراج</td><td>Bioreba</td><td>420100</td><td></td></tr><tr><td>غرفة النمو FS-WI</td><td>أنظمة الفوتون Insturments</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>الخالط اليدوي</td><td>Bioreba</td><td>400010</td><td></td></tr><tr><td>Hawita Special Substrate</td><td>HAWITA Gruppe</td><td>2000000071701</td><td>الركيزة الجاهزة للاستخدام ، مصنوعة من الخث (H4-H6 و H6-H8)</td></tr> <tr><td>حمض الهيدروكلوريك (HCl)</td> <td>Merck</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>شريط الملصقات</td><td>Sigma</td><td>L8144-5EA</td><td></td></tr><tr><td>كمبيوتر محمول مثبت مع تثبيت DinoCapture 2.0 &amp; nbsp ؛</td>يجب أن يكون <td>كمبيوتر HP</td><td>Z2V77EA#BED</td><td>قابلا للتحويل حيث تشارك التجربة في غرفة النمو</td></tr><tr><td>Murashige و Skoog المتوسطة</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M02220100</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Emsure</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Emsure</td><td>1064700250</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur ماصة  0.5 مل</td><td>العلامة التجارية</td><td>21500209</td><td></td></tr><tr><td>مقياس الأس الهيدروجيني</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML1601</td><td></td></tr><tr><td>صناديق بلاستيكية &amp;nbsp ؛</td><td>Cvetlice Dornig</td><td>VCG10.5</td><td>نصف قطر = 10.5 سم</td></tr><tr><td>أواني بلاستيكية &amp;nbsp ;</td><td>مختبر شركاه</td><td>DIS40003</td><td>نصف قطر = 11.5 سم (أعلى) ، نصف القطر = 9.8 سم (أسفل)</td></tr> <tr><td>Saccharose</td><td>Kemika d.d.</td><td>1800408</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي إيثيل ديثيوكاربامات الصوديوم (DIECA)</td> <td>سيجما ألديتش</td><td>228680</td> ثنائي <td>إيثيل ديثيوكاربامات ثلاثي هيدرات الصوديوم ، كاشف ACS</td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)</td> <td>شفرات جراحية معقمة من ميرك</td><td>106462</td><td></td></tr> براون <tr><td></td><td></td><td>4511733633</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط</td><td>براون</td><td>BD033R</td><td></td></tr></tbody></table>

دراسة بدء موت الخلايا باستخدام المجهر الرقمي

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

المقاومة الممنوحة للاستجابة شديدة الحساسية (HR) هي استجابة دفاعية فعالة يمكن تحديدها بواسطة جينات المقاومة N . يتجلى HR على أنه تشكيل مناطق موت الخلايا على الأوراق الملقحة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لدراسة معدل بدء موت الخلية عن طريق تصوير الأوراق الملقحة في الوقت بين بدء موت الخلية وظهور موت الخلية باستخدام المجهر الرقمي. يتيح المجهر الرقمي عملية تصوير مستمرة في الفترات المرغوبة ، مما يسمح بتحديد دقيق لمعدل بدء موت الخلايا حتى دقائق بالضبط ، بدلا من الساعات في الطرق التقليدية. التصوير باستخدام المجهر الرقمي مستقل أيضا عن الضوء وبالتالي يمكن استخدامه أثناء النهار والليل دون الإخلال بإيقاع الساعة البيولوجية للنبات. يمكن دراسة الأنظمة المرضية المختلفة التي تؤدي إلى تطور موت الخلايا المبرمج باستخدام هذا البروتوكول مع تعديلات طفيفة. بشكل عام ، يسمح البروتوكول بتحديد بسيط ودقيق وغير مكلف لمعدل بدء موت الخلايا.

توضح هذه الدراسة بروتوكولا خطوة بخطوة لدراسة بدء موت الخلايا من خلال حدوث الآفة على السيرة الذاتية للبطاطس. ريوال ، مع المجهر الرقمي. وهذا يتيح تحديد الوقت الدقيق لبدء موت الخلية المبرمج.
وضعت النباتات التي وضعت جذورها في التربة 2 أسابيع بعد السيرة الذاتية للبطاطس. الانتشار الدقيق ريوال (الشكل 1 أ ، ب). بعد 3-4 أسابيع من النمو في ظل الظروف الموصوفة ، تم استخدام النباتات التي تحتوي على 3-4 أوراق مكتملة النمو على الأقل مع منشورات مرئية تبدو صحية ، مع عدم وجود علامات انقطاع ، لمزيد من التحليل (الشكل 1C). باستخدام المجهر الرقمي كما هو موضح في هذا البروتوكول ، لاحظنا نفس المنطقة على الورقة الملقحة كل 15 دقيقة وحددنا حدوث الآفة وتمددها في الوقت المناسب (الشكل 3). حدثت الآفة في 15 ساعة و 30 دقيقة (الشكل 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig01.jpg"> الشكل 1: تحضير النبات للتحليل باستخدام المجهر الرقمي . (أ) صندوق بلاستيكي بوسط MS 30 وسيرة البطاطس. نباتات نبات ريوال تحتوي على العقد. (ب) السيرة الذاتية للبطاطس. نبات ريوال في التربة (2 أسابيع بعد التكاثر الدقيق). (ج) السيرة الذاتية للبطاطس. نبات Rywal ، جاهز للتلقيح (بعد 4 أسابيع من وضعه في التربة) ، يحتوي على ثلاث أوراق مكتملة النمو على الأقل. (د) الورقة الملقحة الثانية (السهم) من السيرة الذاتية للبطاطس. مصنع ريوال وضعت وشل حركتها (السهم) مع الشريط. (ه) وضع النبات تحت المجهر الرقمي مع توجيه السهم إلى القرص المستخدم للتركيز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig02.jpg"> الشكل 2: إعداد البرامج الرقمية لتسجيل تطور الآفة. ( أ) واجهة البرنامج - محاطة بدائرة باللون الأحمر هي خيارات للزر الخاص ب (1) إعدادات الكاميرا و (2) إعدادات التقاط الصور و (3) حفظ الصور. (B) نافذة مع إعدادات الكاميرا ، والتي تفتح بنقرة واحدة على (1) في اللوحة A. يجب ضبط السطوع والتباين والتشبع والحدة وجاما بشكل صحيح. (C) نافذة مع إعدادات التقاط الصور ، والتي تفتح بنقرة على (2) المشار إليها في اللوحة A. (D) نافذة مع إعدادات حفظ الصورة ، والتي تفتح بنقرة على (3) المشار إليها في اللوحة A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig03.jpg"> الشكل 3: تكون الآفة على الورقة الملقحة التي لوحظت تحت المجهر الرقمي. صور للجزء المركزي من أوراق البطاطس الملقحة ب PVY عند تكبير 23.6x كما يظهر تحت المجهر الرقمي ، تم التقاطها على فترات 5 دقائق. تم وضع النباتات الملقحة عند 28 درجة مئوية لمدة 3 أيام ، وفي اليوم الثالث ، بدأت المراقبة باستخدام مجهر رقمي عند 22 درجة مئوية في الساعة 7:00. (أ) في الساعة 21:02 ، لم تكن الآفة مرئية بعد ، (ب) بعد 90 دقيقة ، الساعة 22:32 ، تكون الآفة مرئية. (ج) لوحظ توسع الآفة في الساعة 01:02 و (د) 07:32 في صباح اليوم التالي. تكررت التجربة مرتين ، وحدثت الآفات بعد 8 ساعات و 15 دقيقة ، و 12 ساعة بعد بدء موت الخلية ، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

نقدم هنا بروتوكولا لدراسة معدل بدء موت الخلايا المبرمج عن طريق التصوير المستمر للأوراق الملقحة بعد تحريض موت الخلية.

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

للبدء ، انقل نباتات البطاطس المصابة بالفيروس إلى غرفة نمو يتم الحفاظ عليها عند 22 درجة مئوية. اختر نباتا للمراقبة واستخدم شريطا لاصقا لشل حركة الورقة الملقحة الثانية بالكامل. بعد ذلك ، قم بتوصيل المجهر الرقمي بالكمبيوتر وابدأ تشغيل برنامج التقاط الصور.ضع الورقة تحت المجهر. ثم استخدم القرص للتركيز على سطح الورقة. لضبط إعدادات الكاميرا، انقر فوق زر الإعدادات.الآن اضبط السطوع على 64 ، والتباين على 14 وتدرج اللون على الصفر. بعد ذلك ، اضبط توازن اللون الأبيض ، ثم اضبط التشبع على 47 ، والحدة على الصفر وجاما على خمسة. انقر على أيقونة التقاط الصورة وحدد خيار الفيديو المنقضي زمنيا.بعد ذلك ، قم بتعيين التقاط الصور لكل 15 دقيقة لمدة 24 ساعة. اضغط على زر البدء لبدء التقاط الصورة. لحفظ الصور الملتقطة ، حدد جميع الصور وانقر فوق رمز الحفظ.اختر الآن خيارات التصدير ، ثم اضبط النقاط في البوصة على الحد الأقصى. بمجرد الحفظ ، احذف جميع الصور من البرنامج. لتحرير الصور ، قم بتشغيل برنامج تحرير مثل ImageJ.انقر فوق ملف ، ثم حدد استيراد ، واختر تسلسل الصور لاستيراد التسلسلات الزمنية للصور من مجال رؤية واحد. الصق مسار دليل الصور المحفوظة ، واضغط على موافق. بمجرد اكتمال التحويل ، ستقوم ImageJ تلقائيا بتشغيل مشغل فيديو داخلي يعرض الفيديو النهائي.انقر فوق ملف ، ثم احفظ باسم وحدد تنسيق AVI لتصدير ملف الفيديو. عند فتح نافذة صغيرة ، اضبط معدل الإطارات على 0.3 إطارا في الثانية ، ثم اضغط على موافق لحفظ الفيديو كملف AVI. تم استخدام نباتات البطاطس الملقحة التي يبلغ عمرها ثلاثة إلى أربعة أسابيع مع ما لا يقل عن ثلاثة إلى أربعة أوراق مكتملة النمو للتحليل المجهري الرقمي.لوحظت نفس المنطقة على الورقة الملقحة كل 15 دقيقة لتحديد حدوث الآفة وتمددها بمرور الوقت. في 14 ساعة من الملاحظة ، لم تكن هناك آفة مرئية. بعد حوالي 90 دقيقة ، تم تسجيل آفة مرئية.بدأت الآفة في التوسع بعد ساعتين ، واستمرت في التوسع خلال الساعات الثماني والنصف التالية.

studying-cell-death-initiation-using-a-digital-microscope

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نقدم بروتوكول بسيط لتصور مناطق موت الخلايا المبرمج (PCD) في أجنة الفئران الجنينية والتمييز الثقافات الخلايا الجذعية (ES) باستخدام صبغة قابلة للذوبان للغاية ودعا LysoTracker.

استخدام LysoTracker لكشف موت الخلية المبرمج في الأجنة والخلايا الجذعية الجنينية التفريق

هنا نحن تصف طريقة فعالة لدراسة ديناميات إزالة الخلايا...

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

وقد تم توثيق النشاط السامة للخلايا من phenanthridine PJ-34 في خلايا السرطان الذين يخضعون الانقسام في الوقت الحقيقي من خلال التصوير متحد البؤر الحية. PJ-34 استئصال سرطان الثدي البشرية MDA-MB-231 الخلايا إيواء خارج centrosomes في الانقسام. على عكس الانقسام ثنائي الوصل العادي، لم تكن متفاوتة المسافات خارج centrosomes في قطبي المغزل في حضور PJ-34.

موت الخلايا المرتبطة الانقسام الشاذ التي لاحظها التصوير متحد البؤر في الخلايا السرطانية لايف

يشير مصطلح التوسع إلى الظاهرة التي تعكس فيها الخلايا المحتضرة عملية انتحار الخلية في مرحلة متأخرة ، وتصلح نفسها ، وتبقى على قيد الحياة في النهاية. نوضح هنا بروتوكولات لاكتشاف وتتبع الخلايا التي تخضع للاستحمام.

استراتيجيات لتتبع القيامة، خلية بقاء ظاهرة التي عكس موت الخلايا المبرمج

ميكرويرادييشن الليزر أداة مفيدة لإجراء دراسات لإصلاح الحمض النووي في الخلايا الحية. يتم عرض نهج منهجي لاستخدام أشعة الليزر فوق البنفسجية للحث على مختلف الآفات الحمض النووي. ونحن قد الأمثل طريقة ميكرويرادييشن المحلية أن يحافظ على دورة الخلية الطبيعية؛ وهكذا، خلايا المشع المضي قدما من خلال الانقسام.

تقنيات الفحص المجهري [كنفوكل] لدراسة تفاعلات البروتين البروتين وحركية في الحمض النووي آفات متقدمة

البحوث المتعلقة بالإشعاعات المؤينة (الأشعة تحت الحمراء)-موت الخلية كلونوجينيك المستحث مهم لفهم آثار الأشعة تحت الحمراء على الأورام الخبيثة وأنسجة طبيعية. وهنا يصف لنا مقايسة خطوة واحدة لتقييم طرق رئيسية من موت الخلايا المستحثة بالأشعة تحت الحمراء كلونوجينيك استناداً إلى مورفولوجيا 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI)-الملون الأنوية تصور بالفحص المجهري الأسفار.

البروتوكول خطوة واحدة لتقييم الوضع من موت الخلايا كلونوجينيك الإشعاع بالفحص المجهري Fluorescence

نحن التقرير أساليب لتوصيف لتمزق الأغشية البلازمية ملكل بوساطة في نيكروبتوسيس بما في ذلك التصوير المجهري خلية العيش التقليدية و [كنفوكل]، وفحص المجهر الإلكتروني، وربط دهني المستندة إلى الرنين المغناطيسي النووي.

توصيف لتمزق الأغشية البلازمية ملكل بوساطة في نيكروبتوسيس

نقدم هنا، بروتوكولا لرصد البقاء على قيد الحياة على أساس خلية واحدة وتحديد المتغيرات التي كثيرا التنبؤ بموت الخلايا.

رصد بقاء الخلايا العصبية عن طريق الفحص المجهري Fluorescence طولية

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للتحقيق في موت الخلايا وقياسه في عضويات القولون البشرية استجابة للاضطرابات السامة للخلايا مثل السيتوكينات. يستخدم هذا النهج صبغة موت الخلايا الفلورية (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) ، والمجهر الفلوري الحي ، وبرنامج تحليل الصور مفتوح المصدر لتحديد الاستجابات العضوية المفردة للمنبهات السامة للخلايا.

القياس الكمي لموت الخلايا الناجم عن السيتوكين في عضويات القولون البشري باستخدام الفحص المجهري الفلوري الحي

يصف هذا البروتوكول طريقة تصوير الخلايا الحية لمراقبة نفاذية الغشاء الليزوزومي أثناء التنخر ، باستخدام مجسات الفلورسنت التي تكتشف التغيرات في سلامة الغشاء الليزوزومي والتحماض.

تصوير الخلايا الحية لنفاذية الغشاء الليزوزومي أثناء داء الننوبات

اكتشف طريقة التصوير المستمر لدراسة بدء موت الخلايا في نباتات البطاطس باستخدام المجهر الرقمي. يتيح هذا البروتوكول مراقبة دقيقة لتكوّن الآفات وتوسعها على مدى 8.5 ساعة.

دراسة بدء موت الخلايا باستخدام المجهر الرقمي

استكشف المزيد من الفيديوهات