ABCG5 / G8 التبلور في بيئة ثنائية الخلية الدهنية لعلم البلورات بالأشعة السينية
أغسطس 25, 2023
يصف هذا البروتوكول إعدادا لتبلور ناقل الستيرول ABCG5 / G8. يتم إعادة تشكيل ABCG5 / G8 إلى ثنائيات للتبلور المعلق والقطرة. لا يتطلب البروتوكول مواد أو ركائز متخصصة ، مما يجعله متاحا وسهل التكيف في أي مختبر لتحديد بنية البروتين من خلال علم البلورات بالأشعة السينية.
مرحبا ، يدرس فريقي نوع فقدان البروتين عبر الغشاء الخلوي ، ونحن نبحث في العلاقة بالطب والبيولوجيا. على وجه التحديد، نحن ننظر إلى بروتين معين يتطلب ATP لدفع وظيفته، وبعد ذلك، يسمى الاسم ناقل الدرج المرتبط بالأدينوسين ATP. على وجه الخصوص ، نحن ننظر إلى علاقة وظيفة الهيكل الأساسي ، ثم نستخدم ذلك لفهم الكثير من الأمراض المزمنة ، وخاصة أمراض القلب والأوعية الدموية.
نظرا لتعقيد تنقية البروتينات الغشائية واستقرارها في درجات الحرارة الأصلية ، فإن الحصول على بلورات البروتين 3D هو التحدي الرئيسي في هذا المجال ، كما أنه يحد من تطبيقات اكتشاف الأدوية. أنشأ فريقنا طرقا في علم البلورات بالتبريد EM والأشعة السينية للدراسات الهيكلية للبروتينات الناقلة للغشاء. وفي السابق ، قام مختبرنا أيضا بحل البنية البلورية لأول مغاير بشري ABCG5 / G8 ، في كل من الحالات المرتبطة بالكوليسترول وكذلك الحالات المرتبطة بالكوليسترول.
يمكن أن توفر نتائجنا طفرة في اكتشاف الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة أو إعادة استخدام الدواء. يمكن أن يؤدي الحصول على بلورات البروتين 3D أيضا إلى تمكين تجارب النقع من أجل التبلور المشترك لمجمعات البروتين والليجند. يهدف مختبرنا إلى تحديد الأساس الجزيئي للتعرف على الدهون ونقلها بواسطة بروتينات نقل الدهون المعتمدة على ATP.
ونهدف أيضا إلى إنشاء طرق جديدة في تطوير الأدوية لدراسة الديناميات الجزيئية والجوانب الهيكلية لناقلات ABC.
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لبلورة ناقل الستيرول ABCG5/G8، باستخدام البايسيلات (bicelles) في عملية البلورة بطريقة القطرة المعلقة. وقد صُمم هذا النهج ليكون بسيطاً وقابلاً للتطبيق في مختلف البيئات المختبرية، مما يسهل تحديد بنية البروتين عبر حيود الأشعة السينية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- البيولوجيا التركيبية
- بروتينات النقل الغشائية
خلفية علمية
- يُعد ABCG5/G8 ناقلاً من نوع كاسيت ربط ATP يشارك في نقل الدهون.
- إن فهم بنيته أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى حول الأمراض المزمنة، ولا سيما أمراض القلب والأوعية الدموية.
- تؤدي التحديات المتعلقة بتنقية بروتينات الغشاء إلى عرقلة جهود اكتشاف الأدوية.
- أوضحت الدراسات السابقة البنية البلورية لـ ABCG5/G8 في حالات مختلفة.
الغرض من الدراسة
- لبحث الأساس البنيوي للتعرف على الليبيدات ونقلها بواسطة ناقلات ABC.
- لتطوير منهجيات جديدة لاكتشاف الأدوية المتعلقة ببروتينات نقل الغشاء.
- لتمكين تجارب البلورة المشتركة لدراسة التفاعلات بين البروتين والرابط.
الطرق المستخدمة
- التعديل الكيميائي لكسور البروتين عن طريق الميثيلة الاختزالية.
- استخدام أعمدة nickel NTA لتنقية البروتين.
- تحضير المحلول المخزون لخلية B من أجل البلورة.
- طريقة انتشار البخار بالقطرة المعلقة لإعداد عملية البلورة.
النتائج الرئيسية
- لوحظ تبلور ناجح لبروتين ABCG5/G8 خلال فترة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين.
- بلغت أبعاد البلورات المناسبة لجمع البيانات عادةً 50 ميكرون في 100 ميكرون في 2 ميكرون.
- تتيح هذه المنهجية إجراء المزيد من الدراسات حول التفاعلات الليبيدية وتطوير الأدوية.
- تساهم النتائج في فهم العلاقة بين البنية والوظيفة لناقلات ABC.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة بنية ABCG5/G8.
- قد تساهم هذه النتائج في تسهيل التقدم في مجال اكتشاف الأدوية للأمراض ذات الصلة.
- سيركز العمل المستقبلي على استكشاف ديناميكيات آليات نقل الدهون.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
يعالج التوضيح البنيوي عالي الدقة لبروتينات ABCG5/G8 في بيئة من الثنائيات الدهنية (lipidic bicelle) عقبة حرجة في عملية اكتشاف الأدوية التي تستهدف بروتينات الغشاء. ويعزز هذا النهج من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف، ويدعم تقليل المخاطر الميكانيكية للمحافظ الاستثمارية التي تركز على الناقلات. كما أن البلورة الموثوقة لناقلات ABC تمكن من تصميم الربيطات الموجهة بنيوياً وتسريع قرارات الفرز في المراحل المبكرة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استقصاء آليات ناقلات الدهون المعتمدة على ATP بدقة ذرية.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال الحفاظ على التشكيل الأصلي للبروتين في بيئات البيسيل (bicelle).
- يسهل تقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف الناقلة المرتبطة بالأمراض المزمنة.
- يوفر قوالب هيكلية لفرز المحافظ الاستثمارية القائمة على الفرضيات.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر بلورات بروتينية مصادق عليها ومناسبة لدراسات نقع اللجين والبلورة المشتركة.
- يوحد عملية تحضير بروتينات الغشاء لضمان سير عمل قابل للتكرار في عمليات الفحص اللاحقة.
- يتيح التقييم الكمي للتفاعلات بين البروتين واللجين عبر حيود الأشعة السينية للبلورات.
- يدعم تطوير مقايسات قابلة للتوسع لمكتبات المركبات التي تستهدف الناقلات.
الأبحاث الانتقالية والسريرية الأولية
- يربط الرؤى الهيكلية بوظيفة الناقلات ذات الصلة بالأمراض في أبحاث القلب والأوعية الدموية.
- يوفر استمرارية من الاكتشاف الجزيئي إلى التحقق قبل السريري من معدلات الناقلات.
- يقلل من مخاطر الترجمة عن طريق توفير معلومات للدراسات الميكانيكية ودراسات المؤشرات الحيوية.
- يتيح التصميم العقلاني للنماذج قبل السريرية بناءً على علاقات البنية والوظيفة للناقلات.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل طريقة التبلور هذه القائمة على البيسيلات (bicelle) ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق الأولي من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة والأبحاث قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات الخاصة بوظيفة الناقل ABC.
- الفحص: توفر بلورات عالية الجودة وقابلة للتكرار للفحص القائم على البنية وتقييم الربيطات.
- التحليلات: تتيح قراءات بنيوية كمية لمقارنة الحالات المرتبطة بالربيطة والحالات الخالية (apo).
- الأبحاث الانتقالية: تربط البنية الجزيئية بنشاط الناقل ذي الصلة بالمرض وتوافق المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لبلورة بروتينات غشائية متنوعة في مسارات اكتشاف الأدوية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من صحة أهداف الناقلات.
- القيمة التشغيلية: توحد معايير بلورة بروتينات الغشاء لضمان إمكانية التكرار والقابلية للتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: توفر بيانات تدعم قرارات المضي قدماً أو التوقف، وتعزز كفاءة رأس المال في البرامج التي تركز على الناقلات.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد الأولويات لأهداف الناقلات بناءً على المخاطر المعدلة، ودفع الأصول الموجهة هيكلياً نحو الأمام.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تقنيات تنقية بلورة البروتينات الغشائية.
- يتطلب الوصول إلى بنية تحتية تحليلية لحيود الأشعة السينية وتوصيف البروتينات.
- يستلزم توحيد معايير تحضير البيسيل (bicelle) وبروتوكولات البلورة بين الفرق المختلفة.
- قد يكون التكيف ضرورياً لعائلات الناقلات المختلفة أو تركيبات الدهون المتنوعة.
- يمكن أن تحد استقرارية البروتين وإنتاجيته من القدرة الإنتاجية وقابلية التوسع في بعض الأنظمة.
