معالجة الأنسجة وعزل الخلايا الليفية الأولية من المهبل البشري
November 22nd, 2024
يوضح هذا البروتوكول تقنية موثوقة وفعالة لعزل الخلايا الليفية الأولية من الأنسجة المهبلية البشرية قبل انقطاع الطمث أو بعد انقطاع الطمث. لا تأخذ البروتوكولات الحالية لعزل الخلايا الليفية المهبلية في الاعتبار تحديات عزل الخلايا عن الأنسجة الهرمة. تم الحصول على الأنسجة المهبلية من النساء بعد جراحة هبوط أعضاء الحوض.
البحث في الاضطرابات التي تؤثر في المقام الأول على الأشخاص من جنس الإناث غير مدروس ويعاني من نقص التمويل. هبوط أعضاء الحوض هو الاضطراب المرتبط بقوة بجنس الإناث. يحدث عندما تضعف العضلات والأربطة وتتسبب في انخفاض أعضاء الحوض في الحوض ، مما يخلق انتفاخا في المهبل.
لا يعرف سوى القليل عن التفاعلات الخلوية في سياق هذه الفيزيولوجيا المرضية ، ولا كيف تؤثر عوامل مستوى الأنسجة على نجاح التدخلات الجراحية. قد يكون عزل الخلايا الليفية الأولية عن المهبل البشري مفيدا لدراسة الآليات البيولوجية الكامنة وراء هبوط أعضاء الحوض. يؤثر هبوط أعضاء الحوض عادة على الأفراد الأكبر سنا أو بعد انقطاع الطمث.
يعد عزل وانتشار دراسة الخلايا الليفية الأولية لهذه الحالة أمرا صعبا بسبب انخفاض عدد الخلايا والقدرة الاستنساخية للمتبرعين الأكبر سنا. تستخدم معظم الأوراق التي تستخدم عينات مهبلية بشرية أنسجة من أفراد ما قبل انقطاع الطمث يعانون من هبوط أعضاء الحوض. على الرغم من أن بعض الأوراق أبلغت عن استخدام عينات من كل من الأفراد قبل انقطاع الطمث وبعد انقطاع الطمث ، إلا أنهم لم يصفوا بتفصيل كاف البروتوكول المستخدم لعزل الخلايا الليفية بنجاح من المتبرعين الأكبر سنا أو بعد انقطاع الطمث.
قد يكون العزل ونمذجة المرض باستخدام الخلايا الليفية من أنسجة ما بعد انقطاع الطمث أمرا ضروريا لفهم الفيزيولوجيا المرضية الخلوية لهبوط أعضاء الحوض لأن هذه الحالة لديها أعلى معدل انتشار لدى الأفراد في العقد التالي لانقطاع الطمث ، وصفنا طريقة لعزل وثقافة تعليق خلية واحدة غنية بالخلايا الليفية من الأنسجة المهبلية البشرية باستخدام مزيج من التفكك الميكانيكي والأنزيمي. توضح هذه المقالة بروتوكولا موثوقا به حول كيفية الحصول على الخلايا الليفية المهبلية البشرية بعد انقطاع الطمث أو الشيخوخة. تم تحليل الأنسجة المحصودة نسيجيا للتحقق من صحة البروتوكول.
قياس وقطع الأنسجة إلى حجم حوالي سنتيمتر واحد مربع. ضمان القياس الدقيق لحجم الخزعة. حضري خزعتين إلى ثلاث خزعات مهبلية إضافية، بقياس سنتيمتر واحد مربع لكل منها من متبرع واحد وضعي الخزعات جانبا.
بعد وضع الخزعة المهبلية في طبق بتري لزراعة الخلايا ، قم بفرم الأنسجة المهبلية إلى أجزاء صغيرة ، باستخدام مشرطين معقمين. تأكد من أن أطراف الشفرات متعامدة مع سطح الأنسجة. ضع ضغطا متساويا وثابتا على سطح الأنسجة باستخدام مشرطين.
قم بإجراء سحب بالتناوب لقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة جدا. كرر تقنية الفرم هذه ، باستخدام مشرطين ، حتى تصبح العينة ذات تناسق موحد مع قطعة إلى قطعتين من ملليمتر. أضف ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من وسائط زراعة الخلايا الخالية من المصل إلى اللوحة ، مع تعليق الأنسجة المفرومة.
ماصة المحلول الذي يحتوي على شظايا الأنسجة لأعلى ولأسفل لتفتيت أي كتل. نقل الحل الذي يحتوي على شظايا الأنسجة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. أضف وسائط زراعة خلايا إضافية خالية من المصل حتى يصبح الحجم الإجمالي 10 ملليلتر.
تخزين Liberase في 230 ميكرولتر القسمة للاستخدام. أضف 230 ميكرولترا من Liberace إلى الأنبوب. احتضان الأنابيب لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية مع تحريض قوي مستمر ، باستخدام خلاط عينة.
الحفاظ على التحريض المستمر. دوامة الأنابيب على فترات 30 دقيقة أثناء الحضانة. عينات الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 3000 G.إزالة وتجاهل المادة الطافية.
أعد تعليق الحبيبات في واحد إلى ملليلتر من وسائط زراعة الخلايا مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ لتخفيف Liberase. ماصة بقوة حتى يتم إعادة تعليق الحبيبات بالكامل. صفي معلق إنزيم الأنسجة عن طريق سحب المحلول برفق فوق مصفاة الخلية.
اسحب معلقات الخلايا من خزعات الأنسجة المتعددة لنفس المتبرع معا. مع مكبس حقنة معقمة سعة خمسة ملليلتر ، اضغط من خلال تعليق إنزيم الأنسجة فوق المصفاة. كرر هذه الخطوة حتى تظهر شظايا الأنسجة المتبقية مضغوطة بالكامل.
لوحة سحبت تعليق الخلية من خزعات مهبلية متعددة من نفس المتبرع على طبق بتري واحد. بعد الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، راقب الخلايا باستخدام مجهر تباين الطور. تأكد من تركيز المجهر على الجزء السفلي من اللوحة.
سيتم إرفاق عدد صغير من الخلايا الليفية بالقاع. فيما يلي تمثيل تخطيطي للبروتوكول ، مع تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية. يوضح الشكل الثاني صورة تباين الطور للخلايا العالقة في اليوم صفر.
الشكل الثالث هو صورة تباين طوري للخلايا الليفية الأولية المهبلية في اليوم 14 من المزرعة عند تكبير 100X من تعليق مسحوب لثلاث خزعات من الأنسجة بسنتيمتر مربع واحد. يوضح الجدول الأول نتائج استخدام بروتوكولات أخرى لمحاولة عزل الخلايا الليفية المهبلية في هذه الدراسة الحالية. تم تحديد الخلايا الليفية عن طريق تلطيخ إيجابي للمنتون.
تم إجراء تحليل التألق المناعي على الأنسجة المهبلية قبل انقطاع الطمث وبعد انقطاع الطمث الموضحة هنا. تم التقاط الصور بتكبير 200X. كما تم تلطيخ الخلايا الليفية المعزولة بأكتين العضلات الملساء ألفا والأكتين F في عينات الأنسجة قبل انقطاع الطمث وبعد انقطاع الطمث.
قمنا بتطوير بروتوكول محسن وموثوق لعزل الخلايا الليفية الأولية من الغشاء المخاطي المهبلي لدى المتبرعين الأكبر سنا. فشل استخدام البروتوكولات المنشورة سابقا للأنسجة الحيوانية والبشرية لتفكك الخلايا الأولية في استخراج أي خلايا ليفية من عينات مهبلية بشرية في هذه الدراسة. نحن نفترض سببين محتملين لتحديات تفكك الخلايا عن الأنسجة المهبلية البشرية.
سمك الجلد من الغشاء المخاطي هو أكبر في المتبرعين الأكبر سنا وبالمقارنة مع الأنسجة غير المخاطية ، ويمكن أن تنخفض كثافة الخلايا الليفية بشكل ملحوظ في الأفراد الأكبر سنا. لا ينبغي تعديل بعض الخطوات الحاسمة. تنفيذ عملية هضم ميكانيكية صارمة للغاية ، باستخدام تقنية المشرطين ، وسحب معلقات الخلايا من ثلاث إلى أربع خزعات كاملة السماكة لمتبرع واحد.
بروتوكولنا له ميزة واضحة. يؤدي الهضم الميكانيكي والأنزيمي إلى غلة أفضل للأنسجة بعد انقطاع الطمث ، ولكن ليس لها تأثير سلبي على عينات ما قبل انقطاع الطمث. نحن نقر بالعديد من القيود على بروتوكولنا.
قد يكون الوصول إلى الأنسجة المهبلية البشرية أمرا صعبا في الحالات التي لا يتم فيها إجراء جراحة هبوط المهبل ، وقد تكون الحاجة إلى سحب معلقات الخلايا لعينات خزعة الأنسجة المتعددة أيضا قيودا. سيكون هذا البروتوكول الخاص بطلب الخلايا الليفية المهبلية البشرية أداة مفيدة للتحقيقات المستقبلية في اضطرابات قاع الحوض ، خاصة في الأفراد بعد انقطاع الطمث ، فضلا عن إضافة مهمة لأبحاث صحة المرأة.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا موثوقًا لعزِل الخلايا الليفية الأولية من الأنسجة المهبلية البشرية، مع التركيز بشكل خاص على التغلب على التحديات المرتبطة بالشيخوخة وانقطاع الطمث. تجمع الطريقة بين التفكك الميكانيكي والإنزيمي لتعزيز إنتاج الخلايا الليفية من كلا المتبرعين قبل انقطاع الطمث وبعده.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- عزِل الخلايا الليفية الأولية
- أبحاث عن تدلي أعضاء الحوض الأنثوية
- التفاعلات الخلوية في الشيخوخة
الخلفية
- يتأثر تدلي أعضاء الحوض بشكل رئيسي بالنساء بعد انقطاع الطمث.
- التفاعلات الخلوية في هذه الحالة غير مفهومة بشكل جيد.
- البروتوكولات الحالية لعزل الخلايا الليفية لا تعالج بشكل كافٍ التحديات المرتبطة بالأنسجة الأكبر سنًا.
الطرق المستخدمة
- تقنيات الهضم الميكانيكي والإنزيمي
- أنسجة مهبلية بشرية مشتقة من متبرعين قبل انقطاع الطمث وبعده
- تحليل نسيجي للتحقق من صحة البروتوكول
النتائج الرئيسية
- تم تطوير طريقة موثوقة لعزل الخلايا الليفية من كلا نوعي المتبرعين.
- تم تحقيق ثقافات الخلايا الليفية بنجاح مع غلات مثالية.
- أدت تعديلات البروتوكول إلى تحسين النتائج بشكل كبير مقارنة بالتقنيات السابقة.
الاستنتاجات
- تشدد الدراسة على أهمية الأساليب المصممة خصيصًا لعزل الخلايا الليفية من الأنسجة المسنة.
- تسهّل هذه الأبحاث فهمًا أفضل لفيزيولوجيا الأمراض لتقلص أعضاء الحوض وتدعم الدراسات المستقبلية في هذا المجال.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Reliable isolation of primary human vaginal fibroblasts from both premenopausal and postmenopausal donors addresses a critical gap in disease-relevant model development for pelvic organ prolapse research. This protocol enables standardized cellular studies across age groups, supporting mechanistic de-risking and translational continuity in women's health R&D. The method enhances predictive confidence for downstream assay development and target validation in tissue remodeling and host-microbiome interaction studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular mechanisms underlying pelvic organ prolapse using age-relevant human fibroblasts.
- Supports functional target validation by providing consistent primary cell sources from diverse donor backgrounds.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling disease-relevant tissue environments.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible fibroblast preparations for quantitative assay development.
- Improves assay reliability by ensuring consistent cell yields from both premenopausal and postmenopausal tissues.
- Enables scalable preparation of primary cells for compound screening and functional studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with the clinical demographic most affected by pelvic organ prolapse.
- Supports translational biomarker discovery by enabling studies in primary cells from older donors.
- Reduces biological risk in preclinical validation by using disease-relevant human tissue sources.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a robust method for generating primary fibroblast cultures from clinically relevant human tissue.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on tissue remodeling and cellular interactions in pelvic organ prolapse.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell-based assay platforms for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of fibroblast yield and phenotype across donor ages.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies with age-matched primary cell models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for primary fibroblast isolation applicable to multiple research programs in women's health.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in disease modeling.
- Operational Value: Standardizes fibroblast isolation across donor ages, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for target and biomarker programs in pelvic floor disorders.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of women's health research initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, mechanical and enzymatic dissociation, and primary cell culture.
- Needs access to surgical human vaginal tissue, particularly from postmenopausal donors.
- Demands standardized instrumentation for tissue processing and cell culture analytics.
- May require adaptation for use with limited tissue availability or alternative biopsy sources.
- Pooling of multiple biopsies per donor is necessary for optimal cell yield, as supported by the protocol.
