إحداث اللدونة طويلة المدى للاستثارة العصبية الجوهرية في الخلايا العصبية في النواة الركبية الجانبية الظهرية
سبتمبر 20, 2024
هنا ، نصف بروتوكولا لتحفيز اللدونة طويلة المدى للاستثارة الجوهرية العصبية في الخلايا العصبية المتتابعة من النواة الركبية الجانبية الظهرية المحفوظة في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي.
يركز بحثنا على دور القنوات الأيونية في اللدونة الوظيفية على اضطرابات الدماغ. على وجه الخصوص ، ندرس هنا ما إذا كانت الخلايا العصبية من المهاد البصري يمكن أن تخضع لمرونة استثارة الخلايا العصبية الجوهرية. لقد أثبتنا لأول مرة أن الخلايا العصبية من النواة الركبية الجانبية تعبر عن مرونة الاستثارة العصبية الجوهرية بعد الحرمان الأحادي أو بعد تحفيز المدخلات الإقليمية.
نحن نقدم طريقة بسيطة للحث على اللدونة طويلة الأمد للاستثارة العصبية في الخلايا العصبية المهادية البصرية للفئران في المختبر. لهذا الغرض ، نستخدم التسجيلات الكهروفيزيائية المشبك والأدوات الدوائية على أنسجة الدماغ خارج الجسم الحي. تثير نتائجنا إمكانية استكشاف اللدونة الجوهرية للنوى البصرية تحت القشرية الأخرى في الدماغ.
للبدء ، قم بإعداد أدوات التشريح ومنصتين من الجليد. ضع الثلج في الخزان الخارجي واملأ غرفة التقطيع في الاهتزاز بمحلول قطع مثلج. ضع رأس الجرذ القتل الرحيم على المنصة المثلجة الأولى ، وباستخدام مقص صغير ، قم بقص فروة الرأس في اتجاه الذيلية ، متبوعا بالجمجمة بشكل ثنائي.
باستخدام ملقط وملعقة حادة ، افتح الجمجمة ، واستخرج الدماغ بسرعة من الجمجمة ، وضعه على منصة الجليد الثانية. قم بعمل شق في المستوى الأمامي لإزالة القشرة الأمامية والبصيلات الشمية ، متبوعا بقطع ثان على مستوى القولون السفلي لإزالة القشرة الخلفية والمخيخ. قم بلصق كتلة الدماغ على لوحة الاهتزاز مع الجانب المنقاري لأعلى.
سقي الدماغ بانتظام أثناء العملية حتى يتم غمره بالكامل في غرفة التقطيع. باستخدام الاهتزاز ، قم بقطع شرائح 350 ميكرومتر تحتوي على النواة الركبية الجانبية الظهرية. ثم ، باستخدام قلم رصاص ، قم بإزالة القشرة والحصين برفق من الدماغ المتوسط.
للبدء ، احصل على شريحة دماغ الفئران التي تحتوي على النواة الركبية الجانبية الظهرية ، أو dLGN ، وقم بتثبيتها في غرفة مغمورة على مجهر عمودي. ضع السلك البلاتيني على شكل حرف U على الشريحة. باستخدام الفحص المجهري للفيديو بالأشعة تحت الحمراء على تباين التداخل التفاضلي ، حدد خلية عصبية سليمة في dLGN لتسجيل مشبك التصحيح.
باستخدام المعالج الدقيق، ضع ماصة التصحيح على الخلايا العصبية المحددة بضغط إيجابي ثابت. اضبط مكبر الصوت على وضع VC وقم بحقن خطوة جهد 10 مللي فولت. اضبط الجهد على 65 مللي فولت تحت الصفر.
بعد ذلك ، اضبط مكبر الصوت على وضع CC ، وقم بموازنة الجسر للتعويض عن مقاومة الوصول ، واحتفظ بالخلايا العصبية عند 65 مللي فولت تحت الصفر. للحصول على البيانات ، قم بتعيين فترة تحكم تبلغ حوالي 10 دقائق بنبضة تيار موجبة بتردد 0.1 هرتز ومراقبة استثارة الخلايا العصبية. بعد ذلك ، لاحظ مقاومة الإدخال للخلايا العصبية طوال الوقت بنبضة سالبة قصيرة من التيار.
بعد فترة التحكم ، استنباط قطارات من 15 مسامير تثيرها 15 خطوة قصيرة من اثنين إلى خمسة مللي ثانية من تيار إزالة الاستقطاب ، يتم تسليمها عند 40 هرتز لمدة 10 دقائق. اختر سعة النبضة الحالية لاستنباط جهد فعل واحد في كل مرة. أخيرا ، اختبر استثارة الخلايا العصبية بعد بروتوكول الحث.
تم تسجيل الخلايا العصبية dLGN في تكوين الخلية بأكملها ، وتم تحفيز LTP-IE عن طريق إطلاق جهد الفعل عند 40 هرتز لمدة 10 دقائق في وجود الغلوتامات المترابطة الأيونية ومضادات مستقبلات GABA. لوحظت زيادة بمقدار ثلاثة أضعاف في عدد إمكانات الفعل بعد 20 إلى 30 دقيقة من تحريض LTP-IE دون أي تغيير في مقاومة المدخلات.
نظرة عامة
تحدد هذه الدراسة بروتوكولاً لاستحثاث اللدونة طويلة الأمد في الاستثارة العصبية الذاتية في العصبونات الموصلة من النواة الركبية الوحشية الظهرية (dLGN) باستخدام شرائح دماغية خارج الجسم. يبحث السؤال الرئيسي فيما إذا كانت عصبونات dLGN يمكن أن تظهر تغيرات في الاستثارة الذاتية بعد التحفيز أو الحرمان. وتشير النتائج إلى وجود تعزيز ملحوظ في الاستثارة العصبية بعد عملية الاستحثاث.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربائية
- اللدونة العصبية
خلفية علمية
- يعد فهم اللدونة الجوهرية أمراً أساسياً لاكتساب رؤى حول وظائف الدماغ واضطراباته.
- قد تلعب العصبونات الموصلة في المهاد البصري دوراً في المعالجة الحسية واللدونة.
- أظهرت الدراسات السابقة أن الاستثارة العصبونية يمكن تعديلها بواسطة العوامل البيئية.
- تعتبر النواة الركبية الجانبية الظهرية (dLGN) حاسمة لنقل المعلومات البصرية، مما يجعلها محوراً ملائماً لدراسة اللدونة.
الغرض من الدراسة
- لاستكشاف مرونة الاستثارة العصبية الجوهرية في عصبونات المهاد البصري.
- لتأسيس طريقة موثوقة لتحفيز وقياس هذه المرونة.
- لتمكين المزيد من الدراسة في النوى البصرية تحت القشرية ذات الصلة.
الطرق المستخدمة
- استخدام شرائح دماغية خارج الجسم (ex vivo) من الجرذ، مع استهداف النواة الركبية الجانبية الظهرية (dLGN) تحديداً.
- تطبيق تقنية تثبيت الرقعة الكهربائية (patch-clamp electrophysiology) لتقييم الخصائص العصبونية.
- استخدام جهود الفعل عالية التردد لتحفيز اللدونة طويلة الأمد.
- تضمنت الخطوات الحرجة تحضير الأنسجة وإجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية تحت ظروف مضبوطة.
النتائج الرئيسية
- إثبات زيادة بمقدار ثلاثة أضعاف في جهود الفعل عقب بروتوكول التحفيز.
- لم يُلاحظ أي تغيير في مقاومة الإدخال، مما يشير إلى حدوث تغير محدد في الاستثارة.
- تدعم النتائج الفرضية القائلة بأن عصبونات dLGN قادرة على اللدونة الذاتية.
- تشير التعديلات الفيزيولوجية الكهربائية إلى مسارات محتملة لمزيد من الاستقصاء.
الاستنتاجات
- تتحقق هذه الدراسة من صحة طريقة لاستحثاث وقياس تغيرات الاستثارة الجوهرية في عصبونات dLGN.
- تساهم النتائج في تقديم رؤى مهمة حول الآليات العصبية للدونة، مع آثار مترتبة على فهم المعالجة البصرية والأهداف العلاجية المحتملة.
- قد تمتد الأبحاث المستقبلية لتطبيق هذه الطرق على مناطق أخرى تحت القشرة لاستكشاف اللدونة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تمثل لدونة الاستثارة العصبية الجوهرية في النواة الركبية الوحشية الظهرية (dLGN) نقطة تحول حاسمة لفهم المعالجة الحسية والدوائر العصبية التكيفية. إن الحث والقياس الموثوق لتعزيز الاستثارة الجوهرية طويل الأمد (LTP-IE) في عصبونات الترحيل في dLGN يتيح تقليل المخاطر الآلية والتحقق من الأهداف في المراحل المبكرة من اكتشاف أدوية الجهاز العصبي المركزي. وتدعم هذه القدرة الثقة التنبؤية في محافظ علوم الأعصاب الترجمية التي تركز على تعديل المسارات البصرية والمهادية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصناعات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- يتيح استقصاء وظائف القنوات الأيونية العصبية وآليات اللدونة في العصبونات المرحلية المهادية.
- يدعم الحد من المخاطر البيولوجية عن طريق عزل تغيرات الاستثارة الذاتية بشكل مستقل عن المدخلات المشبكية.
- يسهل التحقق من صحة الأهداف الوظيفية لمسارات الجهاز العصبي المركزي المتورطة في التكيف الحسي واللدونة.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر نظامًا مُصادقًا عليه خارج الجسم (ex vivo) لقياس التغيرات في الاستثارة العصبية باستخدام تقنية تثبيت الرقعة الكهربائية (patch-clamp electrophysiology).
- يؤسس لبروتوكولات تحفيز قابلة للتكرار لتقوية التشابك طويل الأمد الجوهرية (LTP-IE)، مما يدعم توحيد المقايسات وإمكانية المقارنة بين المختبرات.
- يتيح القياس الكمي لمخرجات جهد الفعل كنقطة نهاية مسحية للمعدِلات الخاصة باللدونة الجوهرية.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يتماشى مع النماذج ذات الصلة بالأمراض فيما يخص المعالجة الحسية والخلل الوظيفي في المهاد.
- يدعم الاستمرارية من الاكتشاف الميكانيكي إلى التحقق قبل السريري من أهداف الجهاز العصبي المركزي التي تؤثر على الاستثارة العصبونية.
- يوفر منصة لتقييم المؤشرات الحيوية الانتقالية للدونة الجوهرية في المسارات البصرية.
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
يضع هذا البروتوكول دراسات لدونة الاستثارة الجوهرية عند نقطة التقاء الاكتشافات المبكرة وأبحاث الجهاز العصبي المركزي قبل السريرية، مما يربط بين التحقق الميكانيكي من الأهداف وتطوير النماذج الانتقالية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتيح اختبار الفرضيات المتعلقة بآليات القنوات الأيونية واللدونة العصبية في خلايا التتابع المهادية.
- الفحص: توفر قراءات كمية وقابلة للتكرار للاستثارة، مما يجعلها مناسبة لتقييم المركبات.
- التحليلات: توفر تردد جهد الفعل ومقاومة الإدخال كمخرجات قوية وقابلة للمقارنة لتقييم الحالة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نتائج اللدونة الذاتية بالنماذج الحسية والمهادية ذات الصلة بالأمراض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة اختبار ex vivo قابلة لإعادة الاستخدام لاستقصاء أهداف ومسارات الجهاز العصبي المركزي.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من أهداف الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتقليل المخاطر الميكانيكية.
- القيمة التشغيلية: توحد عمليات استحثاث وقياس لدونة الاستثارة العصبية من أجل سير عمل البحث والتطوير القابل للتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: توجه قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) لبرامج الجهاز العصبي المركزي التي تستهدف المسارات المهادية والحسية.
- تأثير المحفظة: تدعم ترتيب أولويات أصول اكتشاف الجهاز العصبي المركزي والأصول قبل السريرية بناءً على المخاطر المعدلة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تقنية تثبيت الرقعة (patch-clamp) الكهربائية وتحضير شرائح الدماغ خارج الجسم (ex vivo).
- يستلزم توفر البنية التحتية المتقدمة للتصوير المجهري والتسجيلات الكهربائية الفسيولوجية.
- يتطلب توحيداً صارماً لبروتوكولات التحفيز وتحليل البيانات بين الفرق البحثية.
- قد يتطلب التكيف مع مناطق أخرى من الدماغ أو أنواع أخرى من الكائنات تحسيناً للبروتوكول.
- تقتصر التفسيرات على الظروف خارج الجسم (ex vivo) وقد لا تعكس بشكل كامل تعقيدات الظروف داخل الجسم (in vivo).
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:09
Obtaining Acute Slices of Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus for Intrinsic Plasticity Studies
2:34
Whole-Cell Patch-Clamp Electrophysiology for Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability Induction in Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus
4:25
Representative Results
