Name: قياس الإمساك في نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 20 s
Description: اكتشف طريقة قياس الإمساك في نموذج ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster لمرض باركنسون باستخدام صبغة زرقاء لتقييم زمن عبور الأمعاء. تُساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة الأعراض غير الحركية المرتبطة بالتنكس العصبي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن نقدر الدكتور ميل فياني في مستشفى بريغهام والنساء وكلية الطب بجامعة هارفارد على الهدية الكريمة للتحكم وألفا سينوكلين التي تعبر عن خطوط ذبابة الفاكهة . نحن نعترف بالمصادر التالية لدعم المنح للدكتور أولسن: NINDS K08 ، زمالة جمعية مرض باركنسون الأمريكية جورج سي كوتزياس ، جائزة الباحث المبكر لمرض باركنسون بوزارة الدفاع.

الذباب المستخدم في هذا الفحص: التحكم: nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 / + ؛ ذباب ألفا سينوكلين: nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 ، QUAS-alpha-synuclein / + ؛ 1- و 10 أيام بعد الإغلاق ؛ الذباب من الذكور والإناث (المتزاوج وغير المتزاوج) (انظر جدول المواد).
1. تحضير طعام الذباب المصبوغ
<ol><li>امزج معجون الجل الأزرق الناعم الملون للطعام (انظر جدول المواد) مع الماء المقطر بنسبة 1: 1 (v / v). ملاحظة: استخدم ألوان الطعام التجارية التي تحتوي فقط على أصباغ غير قابلة للامتصاص ، حيث ثبت أن بعض الأصباغ الزرقاء لها تأثيرات وقائية للأعصاب21.</li>
	<li>ضع قوارير طعام الذباب في الميكروويف والتي تتكون من أجار دقيق الذرة القياسي (انظر جدول المواد) على فترات تتراوح من 10 إلى 15 ثانية حتى يذوب الطعام في سائل أو ملاط. لا تدع الطعام يغلي.</li>
	<li>أضف خليط الصبغة إلى كل قارورة من الطعام للحصول على تلوين موحد بين القوارير. امزج خليط الصبغة حتى يصبح الطعام أزرق متجانسا (الشكل 1). أضف كمية من خليط الصبغة الزرقاء بحيث يكون لون الطعام مشبعا ، ولا يوجد اختلاف في اللون بين القنينات. ملاحظة: يجب القيام بهذه الخطوة بعد وقت قصير من وضع الميكروويف ، حيث يتجمد الطعام بسرعة. إذا تجمد الطعام ، ضع القارورة في الميكروويف مرة أخرى.</li>
	<li>اترك قوارير الطعام المصبوغ في الهواء حتى تصلب. ضع منشفة ورقية رقيقة فوق فتحات القارورة أثناء التجفيف لمنع أي ذباب ضال من الهبوط في القارورة.</li>
	<li>بمجرد أن يبرد الطعام ويتصلب ، انقل الذباب الذي سيتم استخدامه للاختبار إلى الطعام الأزرق. ملاحظة: بالنسبة للقوارير الضيقة (25 مم) ، يوصى بإضافة 9-14 ذبابة إلى كل قارورة. بالنسبة للقوارير العريضة (28.5 مم) ، يوصى بإضافة 10-20 ذبابة إلى كل قارورة. لا يتم فصل الذباب حسب الجنس أو تجربة التزاوج ويشمل مجموعة مختلطة من الذباب الذكور والإناث ، مع كل من الإناث المتزاوجة وغير المتزاوجة.</li>
	<li>احتضان القوارير مع الذباب بين عشية وضحاها عند 25 درجة مئوية في حاضنة.</li>
</ol>2. تصوير الذباب
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية (الشكل 2).
<ol><li>في صباح اليوم التالي (الوقت 0) ، تخدير الذباب الممثل بثاني أكسيد الكربون لمدة 60 ثانية. ضع الذبابة بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى.</li>
	<li>باستخدام الكاميرا (انظر جدول المواد) ، التقط صورا للذباب في كل ساعة لتصور كمية الطعام الأزرق المتبقية في الجهاز الهضمي. ملاحظة: لا ينبغي استخدام هذه الذباب للجزء الكمي من الفحص (الخطوة 3) ، لأن التخدير قد يؤثر على النتائج.</li>
	<li>في كل ساعة ، تخدير وتصوير الذباب الجديد.</li>
</ol>3. إجراء مقايسة الإمساك
<ol><li>نقل الذباب المتبقي (غير مخدر) إلى قوارير مع طعام ذبابة الفاكهة القياسية. رقم كل قارورة.</li>
	<li>اترك الذباب في الحاضنة على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.</li>
	<li>بعد 60 دقيقة ، انقل الذباب إلى قوارير جديدة مع طعام ذبابة الفاكهة القياسي. ابدأ تسجيل البيانات من المجموعة الأولى من القوارير.</li>
	<li>ارسم خطا منقطا أسفل طول القارورة لتحديد النقطة التي سيبدأ منها العد.</li>
	<li>احسب يدويا عدد النقاط الصغيرة المستديرة على جدار كل قارورة. لا تحسب النقاط الموجودة على الطعام أو سدادة القارورة.</li>
	<li>ابدأ بحساب عدد النقاط الزرقاء على جدار كل قارورة.</li>
	<li>احسب عدد النقاط غير الشفافة عديمة اللون على جدار كل قارورة. ملاحظة: كل نقطة عبارة عن براز ذبابة ، وهو مزيج من البول والبراز22. في بعض الأحيان ، قد تمشي الذبابة فوق البراز وتترك أثرا ، وفي هذه الحالة ، تحسب النقطة الأصلية فقط ، وليس كل علامة فردية في المسار.</li>
	<li>سجل نسبة النقاط الزرقاء إلى إجمالي عدد النقاط لكل قارورة. ملاحظة: العدد الإجمالي للنقاط هو عدد النقاط الزرقاء على جدار القارورة المضافة إلى عدد النقاط عديمة اللون على جدار نفس القارورة. سيتم استخدام هذا لحساب النسبة المئوية للبراز الأزرق في الساعة.</li>
	<li>كرر الخطوات 3.2-3.8 سبع مرات أخرى ، وجمع البيانات كل ساعة عبر إجمالي 8 ساعات.</li>
</ol>4. تحليل البيانات
<ol><li>ارسم النسبة المئوية لبراز البراز الأزرق في الساعة لكل حالة.</li>
	<li>قارن البيانات بين الشروط. ملاحظة: يمكن تحديد الدلالة الإحصائية ب 3 طرق: من خلال مقارنة النقاط الزمنية الفردية بين الظروف ، أو عن طريق قياس ميل الخط بمرور الوقت ، أو عن طريق مقارنة المنطقة تحت المنحنى.</li>
</ol>

مقايسات الإمساك في ذبابة الفاكهة

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).</li>
<li>Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the environment.</a> Front Neurol. 10, 218(2019).</li>
<li>Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+challenge+test+for+early+detection+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116(2021).</li>
<li>Ueki, A., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+style+risks+of+Parkinson%27s+disease%3A+association+between+decreased+water+intake+and+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation.</a> J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).</li>
<li>Houser, M. C., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis%3A+is+intestinal+inflammation+a+silent+driver+of+Parkinson%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis.</a> NPJ Parkinsons Dis. 3, 3(2017).</li>
<li>Pfeiffer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motor+symptoms+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-motor symptoms in Parkinson's disease.</a> Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).</li>
<li>Klann, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut-brain+axis+and+its+relation+to+parkinson%27s+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review.</a> Front Aging Neurosci. 13, 782082(2021).</li>
<li>Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gut dysfunction in Parkinson's disease.</a> World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).</li>
<li>Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+gut%3A+symptoms%2C+nutrition%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).</li>
<li>Chen, S. J., Lin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microenvironmental+changes+as+a+potential+trigger+in+Parkinson%27s+disease+through+the+gut-brain+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis.</a> J Biomed Sci. 29 (1), 54(2022).</li>
<li>Hawrysh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRKN%2Fparkin-mediated+mitophagy+is+induced+by+the+probiotics+Saccharomyces+boulardii+and+Lactococcus+lactis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis.</a> Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).</li>
<li>Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestine-derived+%CE%B1-synuclein+initiates+and+aggravates+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila.</a> Transl Neurodegener. 11 (1), 44(2022).</li>
<li>Rota, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constipation%2C+deficit+in+colon+contractions+and+alpha-synuclein+inclusions+within+the+colon+precede+motor+abnormalities+and+neurodegeneration+in+the+central+nervous+system+in+a+mouse+model+of+alpha-synucleinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy.</a> Transl Neurodegener. 8, 5(2019).</li>
<li>Diwakarla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATH434+reverses+colorectal+dysfunction+in+the+A53T+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).</li>
<li>Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+Induces+mitochondrial+dysfunction+through+spectrin+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton.</a> Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).</li>
<li>Olsen, A. L., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+%CE%B1-synuclein+promotes+neurodegeneration+characterized+by+a+distinct+transcriptional+program+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo.</a> Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).</li>
<li>Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+and+systemic+signals+couple+nutritional+and+reproductive+status+with+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis.</a> Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).</li>
<li>Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interplay+in+Drosophila+melanogaster%3A+chronic+nutritional+deprivation+in+larval+life+affects+adult+fecal+output%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output.</a> J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).</li>
<li>Popovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+dPerk+in+the+intestine+suppresses+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Cell Death Dis. 14 (3), 206(2023).</li>
<li>Poteet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+actions+of+methylene+blue+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives.</a> PLoS One. 7 (10), e48279(2012).</li>
<li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li>
<li>Schlichting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+network+underlying+circadian+entrainment+and+photoperiodic+adjustment+of+sleep+and+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila.</a> J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

هناك العديد من الخطوات في هذا البروتوكول التي ستساعد في إكمال الفحص بنجاح. أولا ، من المهم التأكد من أن الفترات الزمنية بين كل جولة لكل قارورة متسقة طوال التجربة. سيساعد وضع علامات على القوارير بالأرقام على تجنب الحاجة إلى أوصاف طويلة للنمط الوراثي ، مما يوفر الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، من الأهمية بمكان أن تظل طريقة حساب البراز22 متسقة طوال التجربة. في حين أن البراز الأزرق مرئي على سدادة الطعام والقارورة ، فإن البراز عديم اللون ليس كذلك. لذلك ، لا تحسب النقاط الزرقاء على الطعام أو سدادة القارورة.
مع المقايسات السلوكية ، هناك دائما احتمال وجود تناقضات في النتائج بسبب التقلبات في سلوك الذباب أو المتغيرات غير المعروفة التي تؤثر على الفحص. نوصي باستخدام نفس وسائط ذبابة الفاكهة ، ونفس صبغة الطعام ، ونفس العلامة التجارية للقوارير لجميع التجارب. ومن المثير للاهتمام ، في العديد من التجارب ، لوحظ أن الذباب يميل إلى التغوط بشكل أقل تواترا في وقت مبكر من بعد الظهر ، ربما بسبب إيقاع الذباب اليومي23. ومع ذلك ، فإن هذا السلوك ثابت في كل من الذباب الضابط والذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين ، لذلك لا ينبغي أن يثير المخاوف.
إذا كان الذباب لا يفرز البراز الأزرق في بداية الفحص ، فمن المحتمل أن الصبغة المستخدمة ليست مصطبغة بدرجة كافية. في هذه الحالة ، يمكن للمرء زيادة نسبة الصبغة إلى الماء المقطر وفقا لذلك. من الممكن أيضا أنه عندما لا يتبقى سوى كمية صغيرة من الطعام الأزرق في الجهاز الهضمي للذبابة ، فقد يكون من الصعب تحديد ما إذا كانت المادة البرازية زرقاء شاحبة أو عديمة اللون. عندما يحدث هذا ، فإن وضع ورقة بيضاء خلف القارورة سيساعد في تحديد لون النقطة البرازية. حتى لو كانت المادة البرازية زرقاء فاتحة جدا ، فمن الأفضل تسجيلها كبراز أزرق بدلا من مادة برازية عديمة اللون.
أحد قيود هذا الفحص هو أنه يتطلب العد اليدوي للبقع البرازية. ولتحسين إمكانية الفحص عالي الإنتاجية، يمكن تعديل هذا البروتوكول في المستقبل للسماح بالقياس الكمي الآلي للبقع البرازية الزرقاء التي ينتجها الذباب الفردي في ألواح متعددة الآبار. هناك قيد آخر وهو أنه على الرغم من أن نموذج ألفا سينوكلين لديه القدرة على تطويره إلى نموذج بادري لمرض باركنسون ، إلا أنه لم يتم بعد تحديد النقطة الزمنية المثلى التي يوجد فيها الإمساك دون تنكس عصبي.
باختصار ، تقدم هذه الطريقة نهجا بسيطا ومباشرا لنمذجة الإمساك ، وهو أحد أعراض PD غير الحركية غير المدروسة ، في نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون.

مرض باركنسون (PD) هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي يتميز سريريا بوجود أعراض حركية مثل بطء الحركة والصلابة والهزة ، مما يؤدي إلى اعتلال كبير1. من الناحية المرضية ، يتم تعريف PD من خلال فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء واختلال ألفا سينوكلين ، مما يؤدي إلى تكوين أجسام ليوي وخلايا ليوي العصبية. لا يزال التسبب في مرض باركنسون غير مفهوم بشكل جيد ، ومن المحتمل أن ينشأ عن تفاعل معقد للعوامل الوراثية والبيئية 2,3. حاليا ، العلاجات المعدلة للمرض غير متوفرة ، ربما يرجع ذلك جزئيا إلى المرحلة المتقدمة من علم الأمراض الموجودة في وقت التشخيص. أظهرت الدراسات أن أكثر من 60٪ من الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء قد فقدت بالفعل بسبب ظهور الأعراض الحركية ، مما يؤكد الحاجة إلى استكشاف المؤشرات الحيوية المحتملة للكشف المبكر عن المرض4. أحد هذه العلامات الحيوية السريرية هو الإمساك ، وهو أمر شائع في مرضى PD 5,6 وقد يسبق ظهور الأعراض الحركية بسنوات أو حتى عقود.
على الرغم من التعريف السريري لمرض باركنسون القائم على الأعراض الحركية ، فإن الإمساك هو واحد من العديد من الأعراض غير الحركية التي يصعب علاجها من الأعراض وتسبب ضعفا كبيرا في نوعية حياة المرضى7. وقد تورطت التغيرات في محور الأمعاء والدماغ ، والذي يمثل الاتصال ثنائي الاتجاه بين الدماغ والجهاز العصبي المعوي ، في التسبب في مرض PD. تم العثور على مجاميع ألفا سينوكلين في عينات الأنسجة من المسالك المعدية المعوية لمرضى باركنسون8 ، وتشير النماذج الحيوانية إلى أن مجاميع ألفا سينوكلين في الجهاز العصبي المعوي تنتشر بطريقة تشبه البريون إلى الجهاز العصبي المركزي9. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر مرضى PD تشوهات في ميكروبيوم الأمعاء10 وقد يعانون من التهاب الأمعاء المفرط11. لم تتم دراسة الإمساك في مرض باركنسون ، مع الإبلاغ عن عدد قليل من نماذج الإمساك المرتبط بمرض باركنسون في الذباب12،13أو القوارض14،15.
يستخدم هذا الفحص نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون حيث يعبر الذباب عن جين ألفا سينوكلين البشري تحت سيطرة سائق الخلايا العصبية الشاملة ، n-synaptobrevin. تظهر هذه الذباب جميع السمات المميزة لمرض باركنسون ، بما في ذلك تراكم ألفا سينوكلين ، والخلل الحركي ، والتنكس العصبي المرتبط بالعمر ، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية16,17. أدخلت الدراسات السابقة قياس ناتج البراز في الذباب لتقييم اختلال وظائف الأمعاء ، وتحديد كمية براز الذباب ومقارنة كميات الفضلات عبر الخطوط الجينية المختلفة للكشف عن الاختلافات الوظيفية في الجهاز الهضمي18،19،20. هنا ، نوضح مقايسة الإمساك باستخدام الذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين البشري. تتيح هذه الأداة البسيطة والقيمة دراسة أحد الأعراض غير الحركية المهمة لمرض باركنسون.

<table><tbody><tr><td>1400 جرام سكروز</td><td>MP Biomedicals</td><td>904713</td><td></td></tr><tr><td>1800 جرام سكر العنب</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td></td></tr><tr><td>2884 جرام خميرة</td><td>MP Biomedicals</td><td>903312</td><td></td></tr><tr><td>428 جرام أجار</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>10253156</td><td></td></tr><tr><td>4600 مل</td><td>دبس الجدة دبس الجدة</td><td>7971942</td><td></td></tr><tr><td>68 لتر ماء</td><td>غير متوفر</td> / <td>أ</td><td></td></tr><tr><td>680 مل خليط تيجوسيبت (1200 جم تيجوسيبت في 6 لتر من الإيثانول)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>6864 جم دقيق الذرة</td><td>طحن اللؤلؤ</td><td>125045</td><td></td></tr><tr><td>800 مل مزيج حمض (83 مل من حمض الفوسفوريك في 1 لتر ماء + 836 مل من حمض البروبيونيك في 1 لتر من الماء)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>برنامج CellSens القياسي</td><td>Olympus</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-Aper</td><td>111ACS200</td><td></td></tr><tr><td>العبادات لقوارير بلاستيكية عريضة</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff قوارير ذبابة الفاكهة العريضة ، البوليسترين</td><td>جينيسي Scientific</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad N</td><td>/ A</td><td>الإصدار 9.5.1</td></tr><tr><td>كاميرا أوليمبوس DP23</td><td>أوليمبوس</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>أوليمبوس SZX12 مجهر ستيريو</td><td>أوليمبوس</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>حمض الفوسفوريك</td><td>فيشر S25470A</td><td></td><td></td>العلمي</tr><tr><td>حمض البروبيونيك</td><td>فيشر Scientific</td><td>A258 - 500 & nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>معجون هلام ناعم لون طعام ، أزرق ملكي</td><td>AmeriColor</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Apex</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>ذبابة الفاكهة الأسهم</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4</td><td>جميع الخطوط المقدمة من Dr. Mel Feany</td><td>N / A</td><td>Lines متوفرة مباشرة من Dr. Feany&nbsp;</td></tr><tr><td>nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 ، QUAS-alpha synuclein </td><td></td><td>N / A</td><td></td></tr> <tr><td>w1118 </td><td></td> <td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

قياس الإمساك في نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون

Measuring Constipation in a Drosophila Model of Parkinson's Disease

الأعراض غير الحركية في مرض باركنسون (PD) شائعة ويصعب علاجها وتضعف بشكل كبير نوعية الحياة. أحد الأعراض غير الحركية السائدة هو الإمساك ، والذي يمكن أن يسبق تشخيص مرض باركنسون بسنوات أو حتى عقود. لم يتم استكشاف الإمساك بشكل كاف في النماذج الحيوانية لمرض باركنسون ويفتقر إلى علاجات محددة. يستخدم هذا الفحص نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون حيث يتم التعبير عن ألفا سينوكلين البشري تحت محرك الخلايا العصبية الشاملة. الذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين يطور السمات المميزة لمرض باركنسون: فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية ، والضعف الحركي ، وشوائب ألفا سينوكلين.
يحدد هذا البروتوكول طريقة لدراسة الإمساك في هذه الذباب. يتم وضع الذباب على طعام الذباب مع مادة مضافة زرقاء اللون طوال الليل ثم يتم نقله إلى الطعام القياسي في اليوم التالي. يتم نقلهم بعد ذلك إلى قوارير جديدة مع طعام ذبابة قياسي كل ساعة لمدة 8 ساعات. قبل كل عملية نقل ، يتم حساب النسبة المئوية للبقع البرازية ذات اللون الأزرق مقارنة بإجمالي بقع البراز على جدار القارورة. الذباب الضابط الذي يفتقر إلى ألفا سينوكلين يطرد جميع الصبغة الزرقاء قبل ساعات من الذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مراقبة مرور الطعام ذو اللون الأزرق من القناة الهضمية من خلال التصوير الفوتوغرافي البسيط. تتيح بساطة هذا الفحص استخدامه في الشاشات الجينية أو الكيميائية الأمامية لتحديد معدلات الإمساك في ذبابة الفاكهة.

نظرا لأن بطن ذبابة الفاكهة شفاف ، يمكن تصور الطعام الأزرق داخل القناة الهضمية في الذباب الحي المخدر. يمكن تقييم الاختلافات النوعية في عبور الأمعاء من خلال التقاط صور للذباب في نقاط زمنية مختلفة. في الذباب الضابط ، يتم طرد الطعام الأزرق بسرعة ، بينما في ذباب ألفا سينوكلين ، يظل الطعام الأزرق موجودا في القناة الهضمية لمدة تصل إلى 8 ساعات (الشكل 2).
يظهر ذباب ألفا سينوكلين تنكسا عصبيا مرتبطا بالعمر ، مع تطور النمط الظاهري القوي لمدة 10 أيام بعد الانقلاب10. في هذه النقطة الزمنية ، تظهر الاختلافات في وقت عبور القناة الهضمية عند مقارنتها بالذباب الضابط من خلال مقارنة النقاط الزمنية الفردية بين الظروف ، أو عن طريق قياس ميل الخط بمرور الوقت ، أو عن طريق مقارنة المنطقة الواقعة أسفل المنحنى (الشكل 3). لم تلاحظ أي فروق في عبور الأمعاء بين السيطرة وذباب ألفا سينوكلين في نقطة زمنية مبكرة ، اليوم 1 بعد الانسداد ، عندما لا يكون الخلل الحركي والتنكس العصبي موجودين بعد (الشكل 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2.jpg"> الشكل 1: قوارير الطعام الزرقاء وبقع البراز. (أ) تحتوي جميع القوارير على طعام أزرق اللون. في هذه المرحلة الزمنية ، تم إدخال الذباب للتو إلى الطعام الأزرق ، ولا توجد مادة برازية زرقاء مرئية. (ب) نقل قارورة بعد ذباب w1118 إلى طعام طازج لمدة 1 ساعة، ثم أزيلت. يتم تكبير الجزء الداخلي الأيسر في (C) ، ويتم تكبير الجزء الداخلي الأيمن في (D). ج: منطقة مستبعدة من التحليل بسبب وجود طعام الذباب. (د) منظر موسع للبقع البرازية، يشير إلى اللون الأزرق (الأسهم السوداء) والبقع غير الزرقاء (الأسهم الصفراء). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig02.jpg"> الشكل 2: تصور عبور الأمعاء للطعام المصبوغ بمرور الوقت. تم ترك الذباب الضابط والذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين البشري في الخلايا العصبية على الطعام المصبوغ باللون الأزرق طوال الليل ثم تم نقله إلى الوسائط القياسية في اليوم التالي. تم نقل الذباب بشكل متسلسل إلى طعام ذبابة قياسي جديد كل ساعة. يتم عرض الصور التمثيلية في الوقت صفر و 2 و 4 و 6 و 8 ساعات بعد النقل. يظهر ذباب التحكم وذباب ألفا سينوكلين بقعا مماثلة من الطعام الأزرق في الأمعاء في الوقت صفر. في نقاط زمنية لاحقة ، يحتوي ذباب التحكم على طعام أزرق أقل من ذباب ألفا سينوكلين ، ويختفي كل الطعام الأزرق عند نقطة زمنية 8 ساعات في الذباب الضابط. الأنماط الجينية لكل خط ذبابة هي كما يلي: التحكم (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 / +) ؛ ذباب ألفا سينوكلين (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 ، QUAS-alpha-synuclein / +). تستخدم إناث الذباب للتصوير نظرا لقدرتها الأسهل على تصور البطن بسبب حجمها الأكبر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig2v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2.jpg"> الشكل 3: مقايسة الإمساك في اليوم 10 ذباب ما بعد الإقلاع. تم ترك الذباب الضابط والذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين البشري في الخلايا العصبية على الطعام المصبوغ باللون الأزرق طوال الليل ثم تم نقله إلى طعام الذباب القياسي في اليوم التالي. تم نقل الذباب بشكل متسلسل إلى وسائط قياسية جديدة كل ساعة. أ: النسبة المئوية للبراز الأزرق في الساعة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. N = 6 قوارير لكل نمط وراثي ؛ كل قارورة تحتوي على 9-14 الذباب. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية في Graphpad Prism (انظر جدول المواد). تم حساب الدلالة الإحصائية في كل نقطة زمنية باستخدام ANOVA. تم حساب ميل الخط والفرق بين المنحدرات باستخدام تحليل الانحدار الخطي. (ب) حسبت المساحة أسفل المنحنى لكل نمط جيني. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. الأنماط الجينية لكل خط ذبابة هي كما يلي: التحكم (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 / +) ؛ ذباب ألفا سينوكلين (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 ، QUAS-alpha-synuclein / +). يتم تضمين كل من الذباب الذكور والإناث بأعداد متساوية تقريبا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2.jpg"> الشكل 4: مقايسة الإمساك في اليوم 1 ذباب ما بعد الإكلوز. تم ترك الذباب الضابط والذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين البشري في الخلايا العصبية على الطعام المصبوغ باللون الأزرق طوال الليل ثم تم نقله إلى الوسائط القياسية في اليوم التالي. تم نقل الذباب بشكل متسلسل إلى طعام ذبابة قياسي جديد كل ساعة. أ: النسبة المئوية للبراز الأزرق في الساعة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. N = الحد الأدنى 5 قوارير لكل نمط وراثي ؛ كل قارورة تحتوي على 9-14 الذباب. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية في Graphpad Prism. تم حساب الدلالة الإحصائية في كل نقطة زمنية باستخدام ANOVA. تم حساب ميل الخط والفرق بين المنحدرات باستخدام تحليل الانحدار الخطي. (ب) حسبت المساحة أسفل المنحنى لكل نمط جيني. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. الأنماط الجينية لكل خط ذبابة هي كما يلي: التحكم (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 / +) ؛ ذباب ألفا سينوكلين (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 ، QUAS-alpha-synuclein / +). يتم تضمين كل من الذباب الذكور والإناث بأعداد متساوية تقريبا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

يقدم هذا البروتوكول مقايسة لنمذجة الإمساك في نموذج ذبابة الفاكهة القائم على ألفا سينوكلين لمرض باركنسون.

Non-motor symptoms in Parkinson's disease (PD) are common, difficult to treat, and significantly impair quality of life. One prevalent non-motor symptom ...

يتم تعريف مرض باركنسون من خلال الأعراض الحركية لبطء الحركة والهزة والصلابة. لكن العديد من المرضى الذين يعانون من مرض باركنسون يعانون من أعراض غير حركية ، والتي يصعب علاجها وتسبب ضعفا أكبر في نوعية الحياة. لم تتم دراسة هذه بشكل جيد في النماذج الحيوانية للمرض ، مما يحد من قدراتنا على إيجاد علاجات جديدة لها.هذا البروتوكول بسيط وغير مكلف ، ولكنه يولد نتائج قابلة للتكرار. إنه سهل التعلم ولا يتطلب معدات متخصصة. باستخدام هذا الفحص البسيط ، يمكننا تقييم الإمساك في الذباب المصاب بالتنكس العصبي.في المستقبل ، نأمل في تطوير نموذج حيث يصاب الذباب بالإمساك قبل ظهور التنكس العصبي. سيسمح لنا ذلك بفهم التسبب في مرض باركنسون بشكل أفضل.

measuring-constipation-in-a-drosophila-model-of-parkinson-s-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

فحوصات لقياس وظائف السلوك الحركي والتعلم والذاكرة والقدرات...

يعاير الحركي ، والتعلم ، والذاكرة في العجز ذبابة الفاكهة نماذج من تنكس عصبي

مرض باركنسون هو اضطراب الاعصاب الذي ينجم عن تدهور الخلايا العصبية الدوبامين في الجهاز العصبي المركزي، مما تسبب عيوب الحركة. نماذج روتنون مرض باركنسون في ذبابة الفاكهة. تلخص هذه الورقة اثنين المقايسات التي تميز أوجه القصور تنقل كل من العفوية والتي يسببها باغت الناجمة عن روتينون.

طرق لتوصيف التلقائي وباغت الناجم عن تحرك في نموذج مرض باركنسون الناجم عن روتنون من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

نقدم مقايسة جيوتاكس سلبية غير مكلفة وموثوقة في ذبابة الفاكهة السوداء كنموذج للاضطرابات التنكسية العصبية. نظرا لكونه أكثر حساسية للعيوب الحركية الخفيفة ، فإن هذا الاختبار سيساعد في فحص التفاعلات الجينية المحتملة والأهداف الدوائية.

التحليل الكمي من العيوب تسلق في نموذج ذبابة الفاكهة من الاضطرابات العصبية

في هذه المقالة, نعرض كيفية استخدام نظام تسجيل النقاط السبع لقياس التغييرات التي تطرأ باستمرار على مورفولوجيا الخلايا العصبية الدوبامين في C. elegans. ويهدف هذا النظام لتحليلات المقايسات التنكس العصبي الدوبامين باستخدام النماذج الوراثية والكيميائية والعمرية من الاضطرابات العصبية.

تحديد مستويات الدوبامين الخلايا العصبية التغيير المورفولوجي وانحطاط في Caenorhabditis elegans

يوضح هذا البروتوكول اختبارا كميا للتغوط في الطافرة الشابة من نوع RAC1/CED-10 المعروفة بالتهاب الكاينورهابديتس إليغانس، مما يوفر نموذجا بسيطا لدراسة مراحل مرض باركنسون التمهيدية المبكرة. يتغلب على قيود نماذج الأخرى ويسهل اختبار استراتيجيات علاجية تستهدف أمراض باركنسون المبكرة.

تقييم حركة الجهاز الهضمي في طفرات التهاب القيء المبكر RAC1 /CED-10 كأداة لدراسة مرض باركنسون المبكر

توضح هذه المقالة الفحص السلوكي يستخدم محرك التزاوج من الذكور في ذبابة الفاكهة melanogaste ص لدراسة الدوافع. باستخدام هذه الطريقة، يمكن للباحثين الاستفادة الطيران المتقدمة تقنيات العصبية الوراثية للكشف عن الآليات الوراثية والجزيئية والخلوية التي تكمن وراء هذا الدافع.

قياس وتغيير التزاوج محرك في ذكر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

هنا توضح لنا كيف جزيء واحد التعريب تنشيط صور مجهرية يمكن الاضطلاع على المحطة الطرفية الأعصاب الحركية ليعيش melanogaster المورفولوجية الثالثة instar اليرقة.

في فيفو تتبع في محطة Presynaptic الأعصاب الحركية المورفولوجية جزيء واحد

هذا البروتوكول يركز على التحليل الكمي لتعقيد أربوريزيشن الجذعية العصبية (نداك) في المورفولوجية، التي يمكن استخدامها لإجراء دراسات ل morphogenesis الجذعية.

التحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية في المورفولوجية

والهدف من هذه المادة هو الخطوط العريضة للخطوات اللازمة لتوليد الفيفيلز من مونوميريك الفا-synuclein ، ومراقبه الجودة اللاحقة ، واستخدام ألياف الليفية التي تم تشكيلها في الجسم المجري.

جيل من الورم الليفي الفا Synuclein المكونة مسبقا من مونومرات واستخدامها في فيفو

هنا نصف نظام RatWalker ، الذي تم بناؤه من خلال إعادة تصميم جهاز MouseWalker لاستيعاب الحجم والوزن المتزايد للفئران. يستخدم هذا النظام الانعكاس الداخلي الكلي المحبط (FTIR) ، والتقاط الفيديو عالي السرعة ، وبرنامج تحليل الوصول المفتوح لتتبع معلمات المشي وقياسها.

تطبيق نظام RatWalker لتحليل المشي في نموذج الفئران الجيني لمرض باركنسون

اكتشف طريقة قياس الإمساك في نموذج ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster لمرض باركنسون باستخدام صبغة زرقاء لتقييم زمن عبور الأمعاء. تُساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة الأعراض غير الحركية المرتبطة بالتنكس العصبي.

قياس الإمساك في نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون

استكشف المزيد من الفيديوهات