رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب
نوفمبر 8, 2006
حسناً، ما أود القيام به اليوم هو توضيح كيفية بناء غرفة تدفق، وهي عبارة عن غرفة دمج للتصوير باستخدام مجهر رأسي. بعد ذلك، أقوم بإنشاء مساحتين باستخدام غشاء رقيق؛ حيث آخذ الـ parafilm وأقطعه إلى شرائح صغيرة.
بعد ذلك سأقوم بتشكيل القنوات للجدران، وأقوم بتجفيفها باستخدام تيار هوائي مائل. أضع غطاء الشريحة فوق البارافين، وهكذا تصبح العملية مكتملة. ثم أقوم بتسخينها على كتلة تسخين لإذابة البارافين وإنشاء ختم إغلاق.
إليك ما لدينا هنا؛ هذه هي شريحة التغطية، وفوق شريحة التغطية توجد طبقتان من فيلم PHIM كما ترى هنا تماماً. وفوق ذلك، توجد مرة أخرى شريحة تغطية بمقاس 22 × 22 ملم. هذه الشريحة هنا، والتي ضغطتُ بها على الفيلم لإتمام عملية الختم.
حسنًا، يتدفق السائل في اتجاه واحد هنا، ويمكنني سحبه باستخدام ورقة ترشيح هنا في هذا الاتجاه. وسأوضح لكم كيفية القيام بذلك بعد قليل. لذا، ما أفضل القيام به هو وضعه في غرفة ترطيب، وهي عملية بسيطة للغاية.
خذ نوعين من الشرائط المرتفعة وضع تحتها ورق ترشيح. وللحفاظ على استقرار التدفق، قم بوضع غطاء السرير الزجاجي على غرفة التدفق. أما طريقة إدخال المحلول إلى الغرفة فهي ببساطة وضع طرف الماصة عند مدخل الغرفة ثم البدء في التقطير.
سأقوم الآن بتحضين الغرفة مع إغلاق الغطاء لمدة 10 دقائق. ولتفريغ السائل من الجانب الآخر، ما أفعله عادةً هو استخدام ورق ترشيح وقصه إلى شرائط رفيعة بهذا الشكل. ثم آخذ أحد هذه الشرائط الرفيعة وأقوم بإضافة المحلول إلى المدخل وفي الوقت ذاته أضع ورق الترشيح عند المخرج لسحب المحلول المستبدل.
سوف تلاحظ تدفق السائل عبر المحلول. ومن ثم أنتظر لمدة خمس دقائق حتى يكتمل الإغلاق. والآن أنا مستعد لوضع actin، حيث يتعين عليّ في الواقع بلمرة actin، وأقوم بعملية البلمرة داخل غرفة التدفق باتباع نفس الإجراءات السابقة.
وبناءً على ذلك، وبعد بلمرة الأكتين، أقوم بغسل كل الأكتين غير الملبمر الزائد باستخدام حجم كبير من المنظم فقط. لدي هنا حوالي 100 µL، وهو ما يعادل عدة أحجام من غرفة التفاعل من المنظم. وعندما يتشبع ورق الترشيح، سيتعين عليّ تغيير الاتجاه. حسناً؟
وبذلك أصبحتُ مستعداً لإجراء التصوير باستخدام هذا النظام. حيث تتوفر غرفة التروية مع اكتين ملتصق بها. الآن سأقوم بوضع الشريحة وتثبيتها تحت المجهر، وبما أنني سأستخدم عدسة شيئية زيتية للتصوير، سأضع بعض الزيت الغمر على السطح العلوي لغطاء الشريحة، وبذلك يتم تقييم المحلول أو البروتين أو أي مادة أخرى تتفاعل مع الأكتين في الداخل.
لذا، ما سأفعله هو أنه يمكنني في الواقع استبدال المحلول من الجانب الآخر بينما أقوم بالتصوير بفاصل زمني. على هذا النحو.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه المقالة كيفية بناء غرفة تدفق وغرفة دمج للتصوير باستخدام مجهر رأسي. تتضمن العملية إنشاء قنوات باستخدام البارافيلم وإغلاقها بإحكام عن طريق التسخين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
خلفية علمية
- تعد غرف التدفق أساسية لمختلف تقنيات التصوير.
- يتيح بناء غرفة دمج تعزيز قدرات التصوير.
- يُستخدم البارافيلم (Parafilm) بشكل شائع في المختبرات لإنشاء سدادات محكمة.
- يعد فهم عملية البناء أمرًا بالغ الأهمية للباحثين في هذا المجال.
الغرض من الدراسة
- تقديم دليل خطوة بخطوة لإنشاء غرفة تدفق.
- توضيح استخدام البارافيلم في إنشاء غرف التصوير.
- تعزيز إمكانية وصول الباحثين إلى تقنيات التصوير.
الطرق المستخدمة
- قص ورق البارافيلم إلى شرائط لتشكيل القنوات.
- تجفيف الشرائط باستخدام تيار هوائي مائل.
- وضع شريحة غطاء فوق ورق البارافيلم.
- تسخين المجموعة على كتلة تسخين لإحكام الإغلاق.
النتائج الرئيسية
- تم بناء غرفة تدفق وظيفية بنجاح.
- كانت عملية الختم فعالة في إيجاد بيئة مستقرة للتصوير.
- تعتبر الطريقة الموضحة قابلة للتكرار للاستخدام المختبري.
- يمكن للباحثين استخدام هذه التقنية في تطبيقات تصوير متنوعة.
الاستنتاجات
- إن بناء غرف التدفق والدمج أمر بسيط.
- يمكن لهذه الطريقة أن تسهل دراسات التصوير المتقدمة.
- إن إمكانية الوصول إلى مثل هذه التقنيات يمكن أن تعزز نتائج الأبحاث.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول تحضيراً قابلاً للتكرار لبيئات دقيقة محكومة لتصوير الخلايا الحية، مما يدعم الدراسات الميكانيكية لديناميكيات الهيكل الخلوي. ومن خلال توحيد تجميع غرفة التدفق، يقلل هذا البروتوكول من التباين في المقايسات القائمة على التروية، مما يحسن اتساق البيانات بين فرق الاكتشاف. تسهل هذه الطريقة التحليل الكمي لحركية تفكك الأكتين، وهي عملية أساسية في حركة الخلايا ونقل الإشارات ذات الصلة بالتحقق من الأهداف في علم الأورام وعلم المناعة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح الملاحظة المباشرة لديناميكيات تفكك الأكتين لاستقصاء منظمات إعادة تشكيل الهيكل الخلوي.
- القيمة التشغيلية: توفر منصة معيارية لاختبار تأثيرات المركبات على عملية تجدد الأكتين في الخلايا الحية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يدعم تطوير قراءات تعتمد على الفلورة لمعدلات تفكك الأكتين كنقطة نهاية لمقايسة وظيفية.
- القيمة التشغيلية: يسمح بتبديل المحلول أثناء التصوير بفاصل زمني لتقييم علاقات الاستجابة للجرعة تحت التروية.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- القيمة العلمية: يربط ديناميكيات الأكتين بالأنماط الظاهرية الخلوية ذات الصلة بالنقيلة، والغزو، وتكوين المشبك المناعي.
- القيمة التشغيلية: يتيح التقييم قبل السريري لمثبطات المسار باستخدام مؤشرات حيوية تصويرية قابلة للقياس الكمي.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من فحص ارتباط الهدف وصولاً إلى التحقق الوظيفي في الأنظمة الخلوية ذات الصلة بالمرض.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بمنظمات الهيكل الخلوي من خلال التصور في الوقت الفعلي لتدفق actin.
- الفحص: توفر قياسات كمية وقابلة للتكرار لتفكك actin تحت ظروف تروية مضبوطة.
- التحليلات: تولد بيانات شدة الفلورة ذات الدقة الزمنية مما يتيح النمذجة الحركية لدوران actin.
- الأبحاث الترجمية: تربط الآلية الجزيئية بالأنماط الظاهرية الخلوية في النماذج قبل السريرية لهجرة الخلايا.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: تؤسس منصة تروية قابلة لإعادة الاستخدام ويمكن تكييفها مع أهداف متعددة للهيكل الخلوي وأنواع مختلفة من الخلايا.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: الحد من المخاطر الميكانيكية للأهداف المشاركة في تنظيم الأكتين من خلال قراءات وظيفية مباشرة.
- القيمة التشغيلية: يحسن التحضير الموحد للغرفة من إمكانية تكرار المقايسة عبر المواقع والمشغلين المختلفين.
- القيمة الاستراتيجية: يتيح اتخاذ قرارات مبكرة بالاستمرار أو التوقف من خلال ربط تعديل الهدف بالنتائج الوظيفية للهيكل الخلوي.
- التأثير على المحفظة: يدعم تحديد الأولويات للمركبات بناءً على المخاطر المعدلة وفقاً لتأثيراتها على أنماط حركة الخلايا وغزوها.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تصوير الخلايا الحية والتحكم في التدفق الميكروفلويدي.
- يعتمد على توفر مجاهر رأسية مزودة بأنظمة تحكم بيئي وقدرات تروية.
- يستلزم توحيد سمك غشاء البارافيلم ومعايير الإغلاق لضمان الاتساق بين الغرف.
- قد يتطلب التكيف مع أنواع الخلايا المختلفة تحسين طلاء السطح وظروف بلمرة الأكتين.
- تشمل القيود العملية التأثيرات المحتملة لإجهاد القص على الخلايا أثناء التروية المطولة، كما هو موضح في البروتوكول.
