رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب
November 8th, 2006
حسنا، ما أود أن أفعله اليوم هو أن أوضح لكم كيفية بناء غرفة تدفق، غرفة اندماج للتصوير على مجهر عمودي. ما أفعله بعد ذلك هو إنشاء مساحتين باستخدام الفيلم. لذا ما أفعله هو أن آخذ الفيلم ، وأقوم بتقطيعه إلى شرائح صغيرة.
بعد ذلك سأقوم بذلك ، سيشكل هذا بشكل أساسي قنوات الجدران ، وأقوم بتجفيفها بهواء مائل. أضع زلة الغطاء أعلى الفقرة ، وها هي الانتهاء. ثم أقوم بتسخينه على كتلة حرارية لإذابة المعلمة وإنشاء ختم بشكل أساسي.
إذن ما هو هذا ، هو زجاج الغطاء هنا ، ثم فوق زجاج الغطاء توجد طبقتان من الرقة كما ترون هنا. ثم فوق هذا ، مرة أخرى ، هناك ، إنها زلة غطاء 22 × ملتين. هذا هنا ، الذي ضغطت عليه على البارام ليسقط الختم.
حسنا ، يدخل السائل في اتجاه واحد هنا ويمكنني امتصاصه بورق ترشيح هنا في هذا الاتجاه. وسأوضح لك كيفية القيام بذلك بعد قليل. لذا ما أحب أن أفعله هو أنني أحب أن أضعه في غرفة رطبة ، وهو أمر بسيط للغاية.
خذ نوعين من الشرائط المرتفعة ولديك مرشح من الورق تحتها. ولإبقائها صاخبة كما أضع الغطاء ، أضع زلة الغطاء على غرفة التدفق. الآن الطريقة التي تقدم بها حلا إلى الغرفة هي أنك تضع طرف الماصة عند مدخل الغرفة وتنقسم للتو.
الآن ما أفعله هو احتضان الغرفة مع إغلاق الغطاء لمدة 10 دقائق. ما أفعله عادة لامتصاص السائل من الجانب الآخر هو استخدامه والحصول على ورق ترشيح وتقطيعه إلى شرائح رفيعة مثل هذه. وآخذ أحد هذه الشرائط الرقيقة وأقوم في نفس الوقت بتطبيق المحلول في المدخل أثناء وضع ورق الترشيح عند المخرج لامتصاص التبادل ، المحلول.
لذلك سترى السائل يتدفق عبر المحلول. ثم أنتظر لمدة خمس دقائق حتى منتصف الإغلاق. الآن ما أنا مستعد للقيام به هو أن أضع في الواقع أن الأكتين والأكتين ، يجب أن أقوم بالبلمرة ، وأنا بلمرة داخل غرفة التدفق وهي نفس الإجراءات من قبل.
لذلك لأنه مثل هذا ، وبعد ذلك الآن بعد أن تم بلمرة الإجراء ، أغسل كل الإجراءات غير المبلمرة الزائدة باستخدام حجم كبير من المخزن المؤقت فقط. إذن لدي هنا حوالي مائة ميكرولتر وهي عبارة عن عدد قليل من أحجام غرفة التفاعل التي تساوي المخزن المؤقت. فقط ، كما تعلم ، عندما يصبح ورق الترشيح مشبعا ، يجب أن أغير الاتجاه. حسنًا؟
ولذا فأنا مستعد لإجراء التصوير بهذا. لذلك غرفة التروية مع الأكتين المرفقة به. الآن آخذ الشريحة ، وأقوم بتثبيتها تحت المجهر ، وبما أنني أقوم بالتصوير باستخدام هدف زيتي ، سأضع بعض زيت الغمر على السطح العلوي للغطاء ، لمسة العشب ، مثل تقييم المحلول أو البروتين أو أي شيء يعمل في الداخل.
لذا ما أفعله هو أنني أستطيع في الواقع تبادل جانب الحل أثناء قيامي بالتصوير بفاصل زمني. على هذا النحو.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
توضح هذه المقالة بناء غرفة تدفق وغرفة اندماج للتصوير على مجهر مستقيم. يتضمن العملية إنشاء قنوات باستخدام parafilm وإغلاقها بالحرارة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
الخلفية
- غرف التدفق ضرورية لتقنيات التصوير المختلفة.
- بناء غرفة اندماج يسمح بقدرات تصوير محسنة.
- Parafilm يُستخدم بشكل شائع في الإعدادات المختبرية لإنشاء الأختام.
- فهم عملية البناء أمر حاسم للباحثين في المجال.
هدف الدراسة
- لتوفير دليل خطوة بخطوة لبناء غرفة تدفق.
- لتوضيح استخدام parafilm في إنشاء غرف التصوير.
- لتعزيز إمكانية الوصول إلى تقنيات التصوير للباحثين.
الطرق المستخدمة
- قطع parafilm إلى شرائح لتشكيل القنوات.
- تجفيف الشرائح بالهواء المائل.
- وضع شريحة غطاء فوق parafilm.
- تسخين التجميع على كتلة حرارية لإنشاء ختم.
النتائج الرئيسية
- تم بناء غرفة تدفق وظيفية بنجاح.
- كانت عملية الختم فعالة في إنشاء بيئة مستقرة للتصوير.
- الطريقة التي تم توضيحها قابلة للتكرار للاستخدام المختبري.
- يمكن للباحثين استخدام هذه التقنية لتطبيقات التصوير المختلفة.
الاستنتاجات
- بناء غرف التدفق والانصهار أمر مباشر.
- يمكن لهذه الطريقة تسهيل دراسات التصوير المتقدمة.
- إمكانية الوصول إلى هذه التقنيات يمكن أن تحسن نتائج البحث.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
