Name: رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: تعلم بناء غرفة تدفق لرصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن باستخدام الميكروسكوب المستقيم. تُستخدم طبقات بارافيلم لتشكيل القنوات وإنشاء ختم حراري مستقر للتصوير.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء غرفة تدفق كما هو مبين في الفيديو. تأكد من أن الختم parafilm ضيق واستخدام coverslips غسلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أكتين ملزم عامل في غرفة ل &#39;5-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة غير محددة على مواقع الربط ساترة الزجاج مع بروتين حظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبلمر أكتين داخل الغرفة التي تتدفق في G - أكتين في البلمرة العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبييض unpolymerized أكتين العازلة التي تتدفق في الزائدة. </li></ol>

رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

حسناً، ما أود القيام به اليوم هو توضيح كيفية بناء غرفة تدفق، وهي عبارة عن غرفة دمج للتصوير باستخدام مجهر رأسي. بعد ذلك، أقوم بإنشاء مساحتين باستخدام غشاء رقيق؛ حيث آخذ الـ parafilm وأقطعه إلى شرائح صغيرة.بعد ذلك سأقوم بتشكيل القنوات للجدران، وأقوم بتجفيفها باستخدام تيار هوائي مائل. أضع غطاء الشريحة فوق البارافين، وهكذا تصبح العملية مكتملة. ثم أقوم بتسخينها على كتلة تسخين لإذابة البارافين وإنشاء ختم إغلاق.إليك ما لدينا هنا؛ هذه هي شريحة التغطية، وفوق شريحة التغطية توجد طبقتان من فيلم PHIM كما ترى هنا تماماً. وفوق ذلك، توجد مرة أخرى شريحة تغطية بمقاس 22 × 22 ملم. هذه الشريحة هنا، والتي ضغطتُ بها على الفيلم لإتمام عملية الختم.حسنًا، يتدفق السائل في اتجاه واحد هنا، ويمكنني سحبه باستخدام ورقة ترشيح هنا في هذا الاتجاه. وسأوضح لكم كيفية القيام بذلك بعد قليل. لذا، ما أفضل القيام به هو وضعه في غرفة ترطيب، وهي عملية بسيطة للغاية.خذ نوعين من الشرائط المرتفعة وضع تحتها ورق ترشيح. وللحفاظ على استقرار التدفق، قم بوضع غطاء السرير الزجاجي على غرفة التدفق. أما طريقة إدخال المحلول إلى الغرفة فهي ببساطة وضع طرف الماصة عند مدخل الغرفة ثم البدء في التقطير.سأقوم الآن بتحضين الغرفة مع إغلاق الغطاء لمدة 10 دقائق. ولتفريغ السائل من الجانب الآخر، ما أفعله عادةً هو استخدام ورق ترشيح وقصه إلى شرائط رفيعة بهذا الشكل. ثم آخذ أحد هذه الشرائط الرفيعة وأقوم بإضافة المحلول إلى المدخل وفي الوقت ذاته أضع ورق الترشيح عند المخرج لسحب المحلول المستبدل.سوف تلاحظ تدفق السائل عبر المحلول. ومن ثم أنتظر لمدة خمس دقائق حتى يكتمل الإغلاق. والآن أنا مستعد لوضع actin، حيث يتعين عليّ في الواقع بلمرة actin، وأقوم بعملية البلمرة داخل غرفة التدفق باتباع نفس الإجراءات السابقة.وبناءً على ذلك، وبعد بلمرة الأكتين، أقوم بغسل كل الأكتين غير الملبمر الزائد باستخدام حجم كبير من المنظم فقط. لدي هنا حوالي 100 µL، وهو ما يعادل عدة أحجام من غرفة التفاعل من المنظم. وعندما يتشبع ورق الترشيح، سيتعين عليّ تغيير الاتجاه. حسناً؟وبذلك أصبحتُ مستعداً لإجراء التصوير باستخدام هذا النظام. حيث تتوفر غرفة التروية مع اكتين ملتصق بها. الآن سأقوم بوضع الشريحة وتثبيتها تحت المجهر، وبما أنني سأستخدم عدسة شيئية زيتية للتصوير، سأضع بعض الزيت الغمر على السطح العلوي لغطاء الشريحة، وبذلك يتم تقييم المحلول أو البروتين أو أي مادة أخرى تتفاعل مع الأكتين في الداخل.لذا، ما سأفعله هو أنه يمكنني في الواقع استبدال المحلول من الجانب الآخر بينما أقوم بالتصوير بفاصل زمني. على هذا النحو.

monitoring-actin-disassembly-with-time-lapse-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

التصوير المجهري للخلايا البطانية يعيش معربا عن GFP - الأكتين يسمح توصيف التغيرات الدينامية في الهياكل هيكل الخلية. على عكس التقنيات التي تستخدم عينات ثابتة ، وهذا الأسلوب يوفر تقييما مفصلا للتغيرات الزمنية في الهيكل الخلوي الأكتين في الخلايا نفسها قبل وأثناء وبعد مختلف المحفزات المادية والدوائية ، أو التهابات.

دراسة الهيكل الخلوي أكتين في الخلايا البطانية لايف تعرب عن GFP - أكتين

الأنابيب الدقيقة هي بطبيعتها غير مستقرة البوليمرات، والتبديل ما بين النمو والسمن العشوائية ويصعب السيطرة عليها. نحن هنا تصف البروتوكولات باستخدام الأنابيب الدقيقة مجزأة مع قبعات استقرار photoablatable. يمكن أن تسبب التحلل من الأنابيب الدقيقة مجزأة مع القرار الزماني والمكاني عالية، مما يساعد تحليل الاقتراحات مع نهايات أنيبيب تفكيك.

إعداد مقسمة ميكروتثبول لدراسة الاقتراحات وانطلاقا من تفكيك أنيبيب ينتهي

ونحن تصف كيفية تمكين التقنيات المتناهية الصغر و photomanipulation مثل فراب وفوتواكتيفيشن تحديد بارامترات حركية وديناميات الزمانية المكانية للبروتينات داخل ترحيل الخلايا. قراءات تجريبية تشمل ديناميات سوبسيلولار ودوران المنظمين حركية أو cytoskeleton أكتين الكامنة.

تقنيات ميكرومانيبوليشن يسمح تحليل الديناميات Morphogenetic ودوران للمنظمين سيتوسكيليتال

نحن نبلغ عن فحص بسيط وفعال للوقت وعالي الإنتاجية يستند إلى التحليل الطيفي للتحديد الكمي لخيوط أكتين في عينات بيولوجية من أنسجة الدماغ للقوارض والموضوعات البشرية.

مطياف مفلور فعال من حيث الوقت لتقييم حالة البلمرة في القوارض وأنسجة الدماغ البشرية

يظهر هنا بروتوكول شامل لإجراء تجارب مشبك قوة فائقة السرعة على محركات الميوسين -5 المعالجة ، والتي يمكن تمديدها بسهولة لدراسة فئات أخرى من المحركات العملية. يفصل البروتوكول جميع الخطوات اللازمة ، من إعداد الجهاز التجريبي إلى إعداد العينات والحصول على البيانات وتحليلها.

تشريح الخصائص الميكانيكية الأنزيمية للميوسينات العملية باستخدام التحليل الطيفي فائق السرعة لقوة المشبك

نحن نقدم بروتوكولات لفحوصات الموائع الدقيقة البسيطة لخيوط الأكتين ، بالاشتراك مع الفحص المجهري الفلوري ، والتي تسمح للمرء بمراقبة خيوط الأكتين الفردية بدقة في الوقت الفعلي مع تعريضها بالتتابع لحلول البروتين المختلفة.

استخدام الموائع الدقيقة والمجهر الفلوري لدراسة ديناميكيات تجميع خيوط وحزم الأكتين المفردة

يصف هذا البروتوكول تكوين طبقات ثنائية دهنية مدعومة وإضافة خيوط هيكلية خلوية وبروتينات حركية لدراسة ديناميكيات الشبكات الهيكلية الخلوية المعاد تشكيلها والمربوطة بالغشاء باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

إعادة تكوين قشرة الأكتين الدنيا المربوطة بالغشاء على الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة

هذا البروتوكول هو دليل لتصور الأكتين الديناميكي والأنابيب الدقيقة باستخدام الفحص المجهري الداخلي الكلي للتألق في المختبر (TIRF).

تصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في المختبر بواسطة المجهر الكلي للتألق الداخلي (TIRF)

يقدم هذا البحث بروتوكولات لهندسة وتوصيف الشبكات المركبة ثلاثية الأبعاد القابلة للضبط لخيوط الأكتين المتشابكة والأنابيب الدقيقة. تخضع المركبات لإعادة هيكلة نشطة وحركة باليستية ، مدفوعة بمحركات الميوسين الثاني والكينيسين ، ويتم ضبطها بواسطة التركيزات النسبية للأكتين والأنابيب الدقيقة والبروتينات الحركية والوصلات المتشابكة السلبية.

إعادة تشكيل وتوصيف مركبات الأكتين-الأنابيب الدقيقة مع ديناميكيات وميكانيكا قابلة للضبط مدفوعة بمحرك

في هذا العمل ، تم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لدراسة المرونة المسامية لجل الأكتوميوسين في ظل ظروف خاضعة للرقابة. يتم تحديد ديناميكيات هلام actomyosin والمذيب المضمن ، والتي من خلالها يتم إثبات مرونة الشبكة المسامية. نناقش أيضا التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهميتها لميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.

ميكانيكا شبكات الأكتوميوسين المرنة (البورية) الانقباضية كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي

هنا ، نقدم طرقا لتحضير مجموعات الأكتين البلورية السائلة شبه ثنائية الأبعاد (2D) المتشابكة والمتشابكة والمتصالبة من البروتينات المنقاة.

ضبط أوضاع الانقباض والتشوه للتجميعات النشطة القائمة على الأكتين في المختبر: من الشبكات النشطة ثنائية الأبعاد إلى قطرات البلورات السائلة

تعلم بناء غرفة تدفق لرصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن باستخدام الميكروسكوب المستقيم. تُستخدم طبقات بارافيلم لتشكيل القنوات وإنشاء ختم حراري مستقر للتصوير.

رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب

استكشف المزيد من الفيديوهات