إنشاء خط خلوي RIP1 Knockout U937 باستخدام نظام CRISPR-Cas9

يركز بحثنا على موت خلايا برنامج الثدييات ، وعلى وجه التحديد دراسة التوازن بين موت الخلايا المبرمج وداء النخر في سياق ارتفاع السكر في الدم. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن بروتين موت الخلية RIP1 كيناز يعدل التعبير الجيني أثناء التكاثر. يتمثل التحدي التجريبي الحالي الذي نواجهه في التلاعب الوراثي بالخلايا المناعية التي تنمو في حالة تعليق ، لا سيما القضاء على جين RIP1 kinase باستخدام CRISPR-Cas9.

يقدم بروتوكولنا ميزتين متميزتين. إنه يحسن طرق تعداء الخلايا المناعية التي تنمو في تعليق باستخدام الفيروس العدسي ، ويلغي الحاجة إلى استنساخ خلية واحدة أثناء عملية إنشاء ضربة قاضية جينية باستخدام CRISPR-Cas9 ، مهدت نتائجنا الطريق لدراسة دور كيناز RIP1 في التحول الناتج عن ارتفاع السكر في الدم في داء النخر. لبدء خط رباعي الإشريكية القولونية التي تؤوي دليل ناقلات الفيروسات العدسية على لوحات Luria-Bertani أو LB agar مع استكمال 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين.

احتضن الصفائح على حرارة 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين حتى تظهر المستعمرات الفردية في المنطقة الأكثر تخفيفا على اللوحة. بعد الحضانة ، باستخدام حلقة معقمة ، حدد مستعمرة واحدة وأضفها إلى خمسة ملليلتر من مرق LB ، مع استكمال 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. قم بتنفيس وشريط لاصق لأسفل غطاء الأنبوب.

احتضان الأنبوب في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة لمدة ثماني ساعات. في هذه الأثناء ، أضف 40 مل من مرق LB ، مع استكمال 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين في أربعة أنابيب سعة 50 مل. بعد الحضانة ، انقل 40 ميكرولتر من الثقافة المزروعة إلى كل أنبوب من الأنابيب الأربعة.

قم بتنفيس أغطية الأنابيب ولصقها قبل احتضانها في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 16 ساعة. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للثقافات عند 3 ، 220 × جم في دوار دلو متأرجح لمدة 20 دقيقة. صب المواد الطافية في دورق نفايات وامزج الكريات الأربع في 10 ملليلتر من مرق LB ، مع استكمال الأمبيسلين.

قم بالطرد المركزي للكريات المدمجة بأقصى سرعة في دوار دلو متأرجح لمدة 20 دقيقة للحصول على حبيبات واحدة والتخلص من أكبر قدر ممكن من المواد الطافية في دورق النفايات. HEK293T البذور الخلايا بتركيز من ثلاثة إلى خمسة في 10 لقوة ست خلايا في قارورة T25 تحتوي على DMEM. احتضن القارورة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد خليط تعداء باستخدام نسبة 1: 1: 1: 1 من البلازميدات ونسبة 3: 1 من كاشف التعداء إلى الحمض النووي للبلازميد مع وسط مصل مخفض. امزج 75 ميكرولتر من كاشف تعداء ، و 2 ، 500 ميكرولتر من وسط المصل المخفض ، و 25 ميكروغراما من إجمالي الحمض النووي للبلازميد. اترك الخليط يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بماصة خليط التعداء بعناية على خلايا HEK293T المتقاربة في القارورة التي تحتوي على الوسائط. قم بتدوير القارورة برفق لضمان التجانس الكافي للمزيج واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد يومين من الحضانة ، انقل الوسائط من قارورة الخلية HEK293T المنتج إلى أنبوب مخروطي 15 مل.

قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 800 × جم لمدة خمس دقائق لحبيبات أي خلايا HEK293T متبقية. قم بإزالة جميع الفيروسات التي تحتوي على مادة طافية بعناية دون إزعاج الحبيبات ونقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. عد واحسب الحجم المطلوب لتعليق الخلية U937 للحصول على حبيبات 2 × 10 أس قوة ست خلايا.

ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية في أنبوب 15 ملليلتر عند 400 × جم لمدة 10 دقائق وصب المادة الطافية ، تاركا حبيبات الخلية في الأنبوب. أعد تعليق حبيبات الخلية في الفيروس الذي يحتوي على مادة طافية وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 290 × جم لمدة 60 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، استخدم ماصة لإعادة تعليق الحبيبات مع الفيروس الذي يحتوي على مادة طافية في الأنبوب.

ضع الأنبوب على محور دوار من طرف إلى طرف لمدة 60 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 10 دقائق وأعد تعليق الحبيبات بنسبة 1: 1 من الفيروس الذي يحتوي على مواد طافية ووسائط RPMI 1640 كاملة ، مع استكمال FBS معطل حراريا بنسبة 10٪. انقل خليط الخلية إلى قارورة جديدة لزراعة الأنسجة T25 واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي لخلايا U937 عند 400 × جم لمدة 10 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات باستخدام وسائط RPMI 1640 الكاملة ، مع 10٪ FBS معطل الحرارة وخمسة ميكروغرام لكل مليلتر من البيورومايسين. انقل مزرعة الخلايا إلى قارورة T25.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، وافحص الخلايا كل يوم إلى يومين بحثا عن علامات النمو. أكد تحليل اللطخة الغربية فقدان تعبير بروتين RIP1 في الخلايا الطافرة RIP1 CRISPR مع عدم وجود إشارة يمكن اكتشافها مقارنة بالإشارة القوية في خلايا التحكم من النوع البري وغير المستهدف. أدى العلاج باستخدام TCZ إلى موت كبير للخلايا المخربة في خلايا التحكم من النوع البري وغير المستهدف ، والذي تم عكسه عن طريق علاج necrostatin-1s.

في المقابل ، أظهرت خلايا RIP1 CRISPR بالضربة القاضية موتا أقل بكثير للخلايا مقارنة بالخلايا الضابطة من النوع البري وغير المستهدف مع عدم وجود تأثير على النيكروستاتين -1s ، مما يشير إلى فقدان وظيفة RIP1. أظهر الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية زيادة كبيرة في إنتاج أكسيد الميتوكوندريا الفائق في خلايا التحكم من النوع البري وغير المستهدف بعد معالجة TCZ ، والتي تم تخفيضها عند معالجة النيكروستاتين -1s. أظهرت خلايا RIP1 CRISPR بالضربة القاضية الحد الأدنى من إنتاج أكسيد الميتوكوندريا الفائق مع عدم وجود تأثير ملحوظ لعلاج النيكروستاتين -1s.