الترسيب المناعي مع جل تقارب مضاد للعلامة Epitope لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين
January 5th, 2024
تعد تفاعلات البروتين والبروتين مهمة لتوضيح وظيفة البروتينات المستهدفة ، ويمكن أن يؤكد الترسيب المناعي المشترك (co-IP) بسهولة مثبطات مضخة البروتون. لقد نقلنا بشكل عابر بلازميد يشفر بروتينا موسوما بالحواتم إلى خلايا HEK-293 وطورنا طريقة ترسيب مناعي لتأكيد ارتباط اثنين من البروتينات المستهدفة بسهولة.
يشمل نطاق بحثنا استكشاف الآليات الجزيئية التي تنظم تطور ووظيفة الدهون البنية والبيج. جذوع وعوامل الاحتكاك والعوامل المساعدة مثل مجمع PRDM 16 و NFIA ومجمع PPR alpha ELK-1 الذي وجدناه مؤخرا يتحكم في مصير الخلايا الدهنية ووظيفتها باللون البني والبيج. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد الحديث المتبادل للخلايا الشحمية للخلايا المناعية كلاعبين رئيسيين.
لتعزيز البحث في مجالك ، نستخدم العديد من التقنيات المتطورة. وتشمل هذه PCR الكمي والترسيب المناعي للكروماتين لتحليل التغيرات في التعبير الجيني وكذلك استدعاء الترسيب المناعي وقياس الطيف الكتلي للتحقيق في التغيرات في تفاعلات البروتين والبروتين ، PPIs ، المرتبطة بالتمايز إلى الخلايا الشحمية البيج. على الرغم من اتباع البروتوكول القياسي للترسيب المناعي ، فإن اكتشاف مثبطات مضخة البروتون غالبا ما يكون صعبا.
تدهور البروتين هو السبب الرئيسي لهذه المشكلة ، والتي يجب أن نتجنبها بعناية. هذا البروتوكول أبسط وأقل تكلفة من التقنيات الأخرى لفحص مثبطات مضخة البروتون ، ولا يتضمن ذوبان الجليد بالتجميد في العملية ، وبالتالي تقليل تدهور البروتين قدر الإمكان.
نظرة عامة
تدرس هذه الدراسة الآليات الجزيئية التي تحكم تطور الدهون البنية والفاتحة، مع التركيز على تفاعلات البروتين-البروتين (PPIs). باستخدام خلايا HEK-293، طور الباحثون طريقة ترسيب مناعي مباشرة لتأكيد هذه التفاعلات، تحديدًا بين DYKDDDDK-PRDM16 وHA-EHMT1.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- الإشارات البيوكيميائية في خلايا الدهون
- تفاعلات البروتين-البروتين في النماذج الخلوية
- تطوير بروتوكولات تجريبية مبتكرة
الخلفية
- أهمية تفاعلات البروتين-البروتين في فهم وظيفة البروتين
- دور تفاعلات الخلايا المناعية والخلايا الدهنية
- التحديات في كشف تفاعلات البروتين-البروتين بسبب تحلل البروتين
الطرق المستخدمة
- الترسيب المناعي المشترك
- خلايا HEK-293 كنظام بيولوجي
- PCR الكمي، قياس الطيف الكتلي، والرحلان الكهربائي
النتائج الرئيسية
- تأكيد تفاعل البروتين بين DYKDDDDK-PRDM16 وHA-EHMT1
- تحسين الطرق لتقليل تحلل البروتين
- التحقق من النتائج من خلال الفحص المناعي
الاستنتاجات
- توضح الدراسة بنجاح نهجًا جديدًا لتأكيد تفاعلات البروتين.
- يحمل هذا الأسلوب آثارًا مهمة للأبحاث البيولوجية المستقبلية في الإشارات الخلوية ووظيفة خلايا الدهون.
الأسئلة المتداولة
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:50
Cell Lysis of Transfected HEK293 Cells and Protein Sample Preparation for Immunoprecipitation
3:02
Preclearing of Transfected HEK293 Protein with the Protein G Gel and Capturing Protein Complexes Using Epitope Tag Affinity Gel
4:17
Eluting Epitope Tag Precipitated Proteins and Immunoblotting for Protein‐Protein Interaction Studies
